基因治疗 一文带你看遍当今的基因治疗

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一个

基因疗法，面对挑战

世界上第一个授权的基因转移研究诞生于1989年的国立卫生研究院。在这项里程碑式的研究中，收集被肿瘤浸润的淋巴细胞，并用逆转录病毒进行基因标记，以检查它们“肿瘤归巢”的能力。本研究首次提供直接证据证明“转基因人体细胞回注患者体内后对人体无害”。截至2012年6月，已在31个国家授权、开始或完成了1843项临床试验。回顾过去，2007年只有28个国家的1309项临床试验，2004年有24个国家的918项临床试验。有趣的是，尽管试验总数在逐渐增加，但在此期间，增长率略有放缓。另一个值得注意的区别在于进入临床试验后期的试验比例，绝大多数临床试验仍停留在临床ⅰ期和临床ⅰ/ⅱ期。

这些早期临床试验大多为基因治疗提供了无价的概念证明，并证实了靶细胞的定向改变可以成功引起细胞表型的改变。然而，在大多数临床功能试验中，转基因细胞的数量不足以达到治疗效果。尽管无效治疗的报告数量有所增加，但基因治疗领域仍在继续发展。其中，最引人注目的是对几种疾病的治疗，如原发性免疫缺陷症、莱博氏先天性黑变病、血友病乙、X连锁肾上腺脑白质营养不良症(X-ALD)。X-ALD是一种致命的脱髓鞘中枢神经系统疾病，由电影《洛伦佐的油》所知。这是慢性疾病载体首次成功应用于人类基因缺陷病的治疗，也是严重中枢神经系统疾病治疗史上的巨大成功。

尽管2012年接受治疗的患者数量仍然很少，但也有报告称首次使用免疫疗法进行了成功的临床试验。在这些实验中，患者经过基因工程改造后可以识别肿瘤T淋巴细胞，而T淋巴细胞的这种功能是由直接靶向γ-逆转录病毒载体编码的肿瘤相关抗原的T细胞受体赋予的。总的来说，临床反应是多种多样的，但重要的是少数患者在接受治疗后得到缓解。2012年，嵌合抗原受体(CARs)作为一种基于自我靶向肿瘤相关细胞表面抗原的自体细胞疗法进入临床实践。费城阿拉伯癌症研究中心的研究人员描述了18名慢性淋巴细胞白血病患者中的3名在接受自体淋巴细胞治疗后的良好早期结果。

表1 .批准的基因治疗药物

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基因治疗的趋势和进展

细胞

自2012年以来，全球已有754项新的基因治疗临床试验。其中最引人注目的领域是利用CAR-T细胞靶向肿瘤相关细胞表面抗原的肿瘤免疫治疗。该方案已被广泛关注，它可以在许多其他肿瘤治疗方案失败时，将细胞毒性T细胞的杀伤潜力和持久性与单克隆抗体杀伤肿瘤的特异性结合起来。2011年《新英格兰医学杂志》报道，一名患者接受了输注CD19的自体T细胞，CD19可表达B细胞特异性抗原，并获得完全缓解。数百名患者在许多试验中接受了CAR-T 19作为激动人心的治疗，并在白血病或淋巴瘤患者，特别是急性淋巴细胞白血病患者中取得了前所未有的缓解率。这种疗法已经成为临床实践中的“免疫疗法”，被科学期刊评为2013年的突破。值得注意的是，截至2017年5月，作为费城儿童医院第一位接受CAR-T细胞治疗的儿科患者，艾米丽·怀特海(Emily Whitehead)已有5年未复发，第一款CAR-T细胞产品——Kymria也于2017年获得FDA批准上市。靶向实体瘤，如胶质母细胞瘤，是当前治疗的一大挑战，相关报道不断增加。

Cellectis正在努力利用TALEN技术编辑来自健康人的T细胞嵌合抗原受体(CAR)，以便从健康人的血液中获得“现成的”免疫治疗产品。这项普通的CAR-T临床试验于2017年2月获得FDA批准，但由于受试者死亡，于2017年9月被FDA停止。患者的死亡原因指向治疗目标CD123的选择，而不是对“通用”CAR的免疫反应，因为两个患者都没有报告GvHD移植物抗宿主反应。目前，这种通用CAR-T的研发还处于不确定状态，但开发“通用”的健康人血肿瘤免疫疗法，对于免疫力低下、自身血液中T淋巴细胞得不到足够的肿瘤患者来说，仍然是一个重要的发展方向。

如今，美国已将CAR-T疗法纳入医疗保险，FDA也批准了全球首个CAR-T疗法Kymriah的第二个适应症——复发或难治性大B细胞淋巴瘤。好消息不断。《细胞》杂志报道了一种超细胞系统。超细胞系统将T细胞从系统的目标感应部分(超细胞系统的抗体部分，用于识别癌细胞上的目标)中分离出来，这使得系统具有切换目标的能力。这种通用的CAR-T是一种分离的、通用的和可编程的(超)CAR系统，用于T细胞治疗。能很好的控制T细胞的活化程度，消除毒性；能够感知多种抗原并对癌症复发做出反应；它还诱导控制细胞类型特异性的信号。该系统的出现有望提供更安全、更有效的癌症治疗。

手机(https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.038)

艾米莉·怀特海2013-2016

单基因遗传病

自上次报告以来，单基因遗传病的治疗取得了巨大而稳定的进展。截至2017年11月，11.1%的临床试验集中于单基因疾病，而2012年、2007年和2004年的历史数据分别为所有试验的8.7%、8.3%和9.8%。

非病毒载体

在囊性纤维化的治疗中，非病毒基因治疗可以改善肺功能的概念已经被一项随机、双盲、安慰剂对照的临床IIB试验所证实。在本实验中，用阳离子脂质体包裹的编码CFTR基因的质粒DNA转导78名患者。虽然作用不大，只对个体受试者起作用，但该试验证明了其安全性，并为今后提高剂量和频率等改进奠定了基础。

γ-逆转录病毒载体

免疫缺陷的临床试验继续显示出显著的临床效果。最近，150多名免疫缺陷患者接受了基于慢病毒的γ-逆转录病毒和基因转移治疗。在腺苷脱氨酶缺乏症(ADA-SCID)的治疗中，40余例患者接受了治疗，疾病生存率超过70%。值得注意的是，Struimviv(葛兰素史克)基于里程碑式的米兰试验，于2016年获得欧洲市场授权管理局(EMA)的批准，代表了欧洲批准的首个针对干细胞的体外基因治疗方案。尽管在长期随访后，在ADA-SCID的治疗中没有观察到与载体遗传毒性相关的不良事件，但使用慢病毒进行治疗的临床试验正在逐渐增加。还报道了用慢病毒治疗原发性免疫缺陷如X连锁严重免疫缺陷(X1-SCID)和Wiskott-Aldrich，其显示出比γ-逆转录病毒载体更好的安全性。

慢病毒载体

慢病毒载体在靶向造血干细胞治疗遗传性神经系统疾病ALD和异养性脑白质营养不良中的应用也取得了令人满意的结果，并且类似的方法也被用于血红蛋白病的治疗，包括镰状细胞病患者的早期报告。在蓝鸟生物赞助的一项试验中，治疗15个月后，镰状球蛋白β抗体水平约为β球蛋白的一半，疾病症状得到纠正。β-地中海贫血的基因治疗，特别是对那些仍有β-球蛋白表达的患者，也是有希望的。在世界范围内进行了六项临床试验。2018年4月19日《新英格兰医学杂志》发表文章称，Leboulch等哈佛医学院研究小组对经BB305载体转导的自体CD34+细胞进行基因治疗，减少或消除了22例重症β地中海贫血患者长期输注红细胞的需要，但未出现与药品相关的严重不良事件。这项里程碑式的实验的成功受到了《新英格兰医学杂志》的高度赞赏，该杂志发表了一篇特别的评论文章。目前，世界上有两项地中海贫血基因治疗的临床试验。Meorial Solan Kattering医院牵头的临床试验采用了相对温和的清髓预处理方法，取得了类似哈佛医学院的满意结果，而地中海贫血基因治疗的国内试验正在广州南方医院进行。

AAV矢量

基于腺相关病毒(AAV)载体的治疗在临床阶段也显示了令人印象深刻的结果，这反映在一些专门的基因治疗杂志上关于该载体系统的特征性讨论中。在这些试验中，应注意α-1抗胰蛋白酶缺乏症、血友病甲和血友病乙以及眼科疾病的基因治疗。用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症的AAV载体于2012年获得欧洲药品管理局的批准，并由优酷公司作为Glybera上市。第一个基于AAV的基因治疗产品voretigenneparvovic被Spark命名为Luxturna，这是FDA咨询委员会一致认可的。该产品将人视网膜色素上皮特异性蛋白65 kDa(RPE65)基因输送到双眼的视网膜下空间，以治疗视网膜营养不良。2017年10月19日，FDA给予Luxturna正式批准。

自2012年以来，A C .纳特瓦尼及其同事(皇家自由医院)启动了血友病B(凝血因子IX丧失)的第二次临床试验。在本实验中，为了获得比先前实验中使用的AAV2更高的基因表达率，使用了血清型AAV8的病毒外壳。关键是AAV8的预存抗体水平比AAV2低。在本实验中，一次性注射表达凝血因子ⅸ基因并由肝脏特异性启动子启动的AAV载体，可以将血浆中凝血因子ⅸ的水平提高到治疗水平(正常水平的1-6%)，这是剂量依赖性的。大剂量注射可观察转氨酶水平的短暂升高，经皮质类固醇治疗后有所改善。更多的血友病B的ⅰ/ⅱ期临床试验是使用天然存在的帕多瓦高活性突变体进行的。在这些实验中，在接受高剂量载体注射的两个患者中观察到由免疫反应引起的转基因表达的降低，并且一个患者需要切换到传统的凝血因子IX注射治疗。另一方面，虽然在10名受试者中观察到两次无症状的肝酶水平升高，但可以通过短期皮质类固醇治疗解决。AAV9血清型的重组AAV病毒已通过治疗神经肌肉脊髓性肌萎缩症(SMA)162型和圣菲利波综合征A型(MPSIIA)应用于临床，表明该病毒能有效穿越人类血脑屏障，并在小鼠模型中取得了一致的结果。

三

基因治疗兴趣的恢复

近年来，行业和分公司对基因治疗表现出了前所未有的兴趣，这反映了对这一领域信心的增加。信心来自于越来越多基于疗效和第一批基因治疗产品的报道，如2012年EMA批准的Glybera (uniQure)和2016年治疗ADA-SCID的SrimoSmithLe(葛兰素史克)。最近，诺华公司开发的首个CAR T细胞治疗产品Kymriah(以前命名为tisagelecleucel-T和CTL019)于2017年8月获得FDA批准。随后，由凯特制药公司开发的商品名为“火花疗法”的“耶斯卡塔”和“卢克斯特纳”的CAR-T治疗产品分别于10月和12月获得美国食品和药物管理局批准上市。学术界也获得了越来越多的行业资助，进一步拓展了基因治疗药物的研发渠道。随着临床思维的改变，大量投资开始进入基因治疗领域，如优化生产工艺，扩大治疗人类疾病所需病毒载体的生产规模，确保商业化生产方法适用于新载体等。在国内，吴家河为中国基因治疗提供AAV、单纯疱疹病毒、慢病毒、ADV载体系统试点和大规模载体生产平台，可为基因治疗产业的快速发展提供支撑。临床医学对基因治疗信心的增加也导致了生物医学领域对潜在有利可图的疾病适应症的激烈竞争。以治疗血友病甲和血友病乙凝血因子缺乏症的AAV载体为例，至少有10家公司已经开始或声称计划分别进行临床试验。

四

进化技术和新的基因治疗平台

基因修复

2012年以来，一个重要的模式变化是更加关注基因补充策略的改变，包括基因编辑和靶基因重组、反义寡核苷酸诱导的外显子跳跃和RNA干扰，这些都已经进入临床实践。这个策略在单纯增加正常基因无法改善的显性疾病数量的过程中非常重要。RNAi(如基因表达的基因下调)的重要性在2006年梅洛获得诺贝尔生理医学奖时得到认可。虽然这些方法的效率通常不足以用于人类疾病的基因治疗，但是在最近的分子治疗周年纪念版中已经报道并综述了使用寡核苷酸诱导的外显子跳跃来治疗杜兴肌营养不良症(DMD)和形状记忆合金治疗的典型病例。2016年，FDA批准了两种用于治疗神经肌肉疾病的剪接调控寡核苷酸。第一个是Eteplisen(Sarepta Theatricies)，已被FDA优先批准用磷酰二胺吗啉反义寡核苷酸治疗DMD。用于治疗SMA患者的nusinersen(spiraza，由Biogen营销)在新药申请提交三个月后被接受，无需转入FDA咨询委员会。

基因组编辑

自从第一个特异性核酸酶被证明能够结合DNA并断裂双链以来，已经过去了近二十年，这极大地促进了位点特异性基因编辑的发展。核酸酶诱导的基因断裂不仅可以用于基因添加和基因破坏，还可以用于基因修复。尽管需要长期随访，但基因编辑技术有着光明的前景。这项技术已应用于治疗艾滋病毒-193和转录样效应物核酸酶激活剂的临床试验，用于治疗两名晚期白血病儿童。最近，一个规则的短回文重复基因簇与cas9(CRISPR/CAS

9)核酸酶显著提高了基因组编辑的效率，尽管它们在30年前首次被报道时仅用作iap基因下游的一组异常核苷酸序列。这种细菌免疫系统被重新定义，导致基因编辑技术的不断革命。据报道，CRISPR/Cas9已被用于灭活60多种猪内源性逆转录病毒，以产生更安全的异种移植物。最近，CRISPR/CAS9修饰细胞首次用于人类癌症治疗。2016年10月28日，四川大学鲁U团队将CRISPR/Cas9转化T细胞引入患者体内治疗转移性肺癌(试验号NCT02793856)，另有7项实体瘤临床试验计划在国内进行。SangaMo疗法也开始使用锌指核酸酶将序列引入白蛋白位点，治疗粘多糖沉积和血友病B(检测号分别为NCT03041324、NCT02702115和NCT02695160)。尽管仍处于临床前阶段，但据报道，使用非同源末端来纠正致病性剪接位点突变可用于治疗小鼠的1A先天性肌营养不良症，并且在某些情况下可能最终取代寡核苷酸诱导的外显子跳跃。该技术的进一步改进，如鉴定靶向作用降低的替代核酸酶，显示了其在基因治疗应用中的潜力，但精确修复大量细胞以获得治疗效果仍是对现有技术的挑战。中国最早使用CRISPR/Cas9对人类胚胎进行基因编辑。最近美国也有相关报道。

对转基因表达的需求日益增加

基因传递系统可分为两类:非病毒理化方法和重组病毒系统。非病毒方法的比较优势包括化学性质的简化、生产的简单性和可重复性、更大的包装容量和减少的生物安全问题。然而，与重组病毒系统相比，非病毒方法效率相对较低，且效果通常较短。然而，核酸稳定性和功效的提高以及脂质和聚合物递送技术的进步正在促进非病毒基因递送系统的发展。相比之下，为了使病毒系统失去复制能力，提高效率，更好地利用其优势，往往对病毒系统进行改造。根据所需修饰的性质，很可能实现核酸、寡核苷酸、适体、转录因子和其他分子的瞬时递送。例如，使用非整合载体、瞬时表达系统和小分子将转录因子转移到诱导多能干细胞(iPS)，安全问题的解决方案在于消除编码转录因子的不必要的长期表达和插入突变。通过限制潜在的非靶效应，Cas9和其他核酸内切酶在基因组编辑中的瞬时表达也可能是有益的，这正在被广泛研究。

银，亚历山大，埃德斯坦，等。2012年全球基因治疗临床试验——最新进展[J]。基因医学杂志，2013，15(2):65。

三个选项专家一起讲课——南京选项实训课

训练时间

2018年5月19-20日(只有40人下班)

培训场所

线下:南京(具体位置待定)

在线:见证直播平台http://mudu.tv。