TCID50 病毒包装实验（二）

病毒包装

名词解释

293T细胞来源于293细胞，表达SV40大T抗原。它们被广泛用于瞬时转染以过度表达各种靶蛋白或包装病毒。

脂质体:一些细胞质中的天然脂质小体，可以作为生物膜捕获外源物质并更有效地转运到靶细胞，与细胞融合后释放出来。

共转染的操作步骤

第一天:

用无抗生素DMEM+10%胎牛血清(2ml/孔)接种293T细胞。保证第二天细胞密度达到80%-90%融合度。

次日:

1)稀释2ug表达质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2。g在1)500微升无血清培养基中。

2)500微升无血清培养基稀释15微升脂质体2000。

3)3)5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静置20min。

4)从6孔板中吸出1毫升无血清培养基，然后滴加1毫升质粒和脂质体的混合物。

5)6-10h后，取出含有DNA-脂质体复合物的培养基，用正常培养基DMED+10%FB代替(从此时开始计算时间)。

第三天:

1)转染24小时后，荧光显微镜下转染效率应达到70%以上。

第四天:

1)转染后48和72小时收获含病毒的上清液。

2)以2)3000转/分钟离心20min，用0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。

3)以12000转/分钟离心浓缩细胞，并在-80℃下储存。

4)效价测定，靶基因验证，出具检测报告。

病毒包装原理

质粒DNA是能转录慢病毒遗传物质(RNA)但不能翻译慢病毒外壳和蛋白质成分的载体质粒。它同时与靶基因和报告基因相连。psPAX2是一种能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物通过粘附机制很容易穿过细胞膜。pMD2。g是慢病毒膜蛋白质粒。通过lipofectamine)2000将三个质粒共转移到靶细胞基因组中，当表达宿主基因组时，从宿主基因转录的靶基因RNA和从psPAX2和pMD2翻译的蛋白质。g基因组装成慢病毒。

在上述程序中提到的“第四天”收集病毒。第五天，用病毒感染目标细胞。病毒进入细胞后，其遗传物质RNA被转录成DNA，基因被重新整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程。由于质粒DNA只能转录病毒RNA并表达目的基因，而不能表达病毒的外壳和膜蛋白成分，不能像普通病毒一样在宿主细胞中反复繁殖，因此对宿主细胞无害，高效地将目的基因转染到目的细胞的基因组中。

慢病毒感染的细胞

荧光显微镜操作流程

打开荧光装置(30分钟内不能关闭，否则会影响显微镜寿命)，将细胞培养板放在台上，调整物镜和光圈，用自然光观察视野内的细胞，然后关灯，打开荧光通道，观察荧光强度，判断感染率。在进行图像采样之前，可以调整曝光时间、增益值和色度，使荧光图像更加完美。

注意事项:

1)病毒浓度要合适，太小的话，细胞受感染的少，但是病毒浓度太大，会对细胞造成伤害。

2)感染病毒时，培养基用量少，保证病毒浓度，培养10小时左右可根据培养基颜色添加培养基。

3)在感染的细胞多样性不清楚的情况下，可以进行浓度梯度感染，计算感染的细胞多样性。

4)加入病毒后，24小时左右可以更换液体，48小时后可以看到荧光，这取决于细胞状态。

感染后细胞检测方法

初步荧光检测

如果有荧光，说明病毒感染成功，但不能确定目的基因是否整合到细胞中。待进一步检测，荧光强弱，与病毒加入量有关。

核糖核酸提取和逆转录聚合酶链反应检测

原理:由于真核生物的DNA含有很多非编码区，真核生物的DNA转录成RNA后，通过切割、剪接、去除这些非编码区，就可以形成真正的mRNA。是否表达真核基因和表达相应的蛋白质，只能通过提取其mRNA和RT-PCR来确定。

核糖核酸提取步骤

1)加入1毫升甲醇，吹净后移入1.5毫升无菌离心管。

2)加入100微升氯仿，剧烈摇动30秒，混合均匀，以12000转/分的速度旋转15分钟，可看到明显的分层。

3)将上层的透明液体放入新的1.5毫升离心管中，加入等体积的异丙醇，混合均匀，静置10分钟，以12000转/分钟离心10分钟，弃去上清液。

4)以12000转/分的速度加入1毫升70%乙醇，离心10分钟，弃去上清液，将剩余液体风干，最后加入DEPC-水溶解RNA，电泳，初步确定RNA的纯度。

逆转录聚合酶链反应步骤

RT是一个逆转录过程。用前一天提取的总RNA，通过添加引物、模板和酶，设置PCR仪的温度，就可以将RNA反转录成cDNA。聚合酶链反应是在模板、引物和酶的作用下，将cDNA复制成双链DNA。

蛋白质提取和蛋白质检测

蛋白质印迹:蛋白质印迹或免疫印迹一般由三部分组成:凝胶电泳、样品印迹和免疫检测。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质在凝胶中按分子量分成条带。在第二步中，在凝胶中被分成条带的蛋白质被转移到固体支持物上。使用最广泛的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜。电泳转移(transfer electric)广泛用于蛋白质转移，分为半干法和湿法。现在多采用湿法。第三步是用特异性抗体检测已经印在膜上的相应抗原。免疫测定方法可以是直接的，也可以是间接的。目前，间接免疫酶标记法应用广泛。与特异性第一抗体杂交结合后，用标记有酶的第二抗体(针对标记有碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)的第一抗体的抗体)进行杂交结合，然后加入酶的底物显色，或通过膜上的颜色或X射线胶片上暴露的条带显示抗原的存在。这项技术被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。

病毒滴度的测定

稀释计数法:

滴度单位:TU/ml，指每ml中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。“TU”是“转导单位”的缩写，中文意思是能感染并进入靶细胞的病毒基因组数量。

第一天细胞准备

将生长状态良好的293T细胞消化计数，稀释至1×105/ml，加入到100 l/孔的96孔板中，每种病毒制备10个孔。放入37℃、5%CO2的培养箱中。

第二天加病毒

在EP管中进行10次梯度稀释，连续稀释10次。稀释方法如下:每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加90 l培养液，第一管加10L病毒原液，混匀，然后吸10L加到第二管混匀。以此类推，做十倍稀释(10~10-8)。在96孔板中吸收原始培养基，并加入稀释的病毒溶液。并做好标记。

第三天，加入培养基

每孔加入100 l完整培养液有利于细胞生长。

第五天观察结果，计算效价

在荧光显微镜下观察结果，并计数最后两个荧光细胞克隆。给定X和y，效价(TU/ml)=(X+Y×10)×1000/2/X孔中病毒溶液的含量(l)。

定量聚合酶链反应方法:

病毒感染前一天，用HOS细胞接种6孔板。每孔有5×104个细胞。接种细胞24小时后，用血细胞计数板计数两孔中的细胞，并测定感染时的实际细胞数，记录为N..

丢弃其他平板中的培养基，并用含有5μg/ml聚芳烃的新鲜培养基替换。浓缩病毒用培养基稀释200倍，即在199μl培养基中加入1μl病毒。向三个培养孔中加入0.5μl、5μl和50μl稀释的病毒。感染开始后20小时，取出培养上清液，用500μl含脱氧核糖核酸酶的新鲜培养基代替。在37℃下消化15分钟，这一步是除去残留的质粒DNA。然后，将其换成2ml正常培养基，并继续培养48小时。

用0.5毫升0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液消化细胞，并在37℃放置1分钟。用培养基清洗后，通过离心收集细胞。基因组DNA按照DNeasy试剂盒的说明提取。向每个样品管中加入200μl洗脱液以洗涤DNA。使用DNA定量试剂盒进行定量(Bio-Rad)。基因组DNA可在-20℃下稳定保存至少2个月。

数据分析:通过基因组数量校准整合在DNA样品中的慢病毒载体的拷贝数，获得整合在每个基因组中的病毒拷贝数。

滴定度(每毫升积分单位，国际单位毫升-1)的公式如下:

IU·ml-1 =(C×n×d×1000)/V

其中:C =每个基因组整合的病毒平均拷贝数；N =感染时的细胞数(约1×105)D =病毒载体的稀释倍数；V =添加的稀释病毒体积。

空点成形单元:

空 spot检测传染性病毒颗粒的数量，是病毒滴度检测的金标准。空斑点形成单位测定是一种准确测定病毒传染性的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到单层细胞生长的培养板、玻璃平板或平板瓶中。病毒吸附在细胞上后，覆盖一层溶解的半固体营养琼脂，凝固后孵育。当病毒在细胞内复制增殖时，每个感染性病毒颗粒在单层细胞内产生有限的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大。如果用中性红等活性染料上色，红色背景上会出现没有上色的“空斑点”，清晰可见。由于每个空斑点是由单个病毒颗粒的复制形成的，所以病毒悬液的滴度可以表示为每毫升空斑点形成单位(PFU)。

TCID50试验(50%组织培养感染剂量):

病毒滴度也可以用这种方法计算，理论上是半感染性病毒颗粒的稀释值，理论上可以换算成logtcid50 = logplaza+0.67。

病毒颗粒检测:

OD260可以检测病毒DNA和蛋白质的浓度，但不能区分完整病毒和感染性病毒以及受损病毒和非感染性病毒。这是一个可以检测所有病毒(包括活病毒和死病毒)内容的物理实验。因此，通过检测OD260可以反映和计算病毒粒子(VP)的浓度。但在检测OD260之前，必须先对病毒进行纯化。

此外，有些病毒还有其他广泛的滴度检测方法，如血凝滴度、OD280等。

病毒载体的应用

1.将目的基因导入细胞研究相关功能，特别是对于难以转染导入的细胞。

2.将目的基因导入细胞系，构建稳定的转化体，使目的基因能够稳定表达，实现相关功能和药物的研究。

3.将过表达的目的基因导入细胞系，构建能产生目的蛋白的真核细胞。

4.将目的基因导入动物组织和体内，获得长期表达。

5.基因疗法。

6.转基因动物。

7.基因敲除。

8.药物研究:构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用。

9.快速建立生产目的蛋白的细胞系，是一种很有前途的真核表达方法。

结束