blocking 【干货】免疫组化中的双染色技巧

免疫组织化学(IHC)是一种探索组织或细胞中蛋白质的常用方法，它使用抗体和抗原来寻找所需的蛋白质位置。但是，为了在同一组织或细胞中发现两种靶蛋白的表达或结构(图1)，或者观察同一组织中不同的细胞类型，双染色技术相对重要，不仅可以节省样品数量和制备时间，还可以有效节省资金。

双重染色是指两种抗原可以在同一样品中定位和检测。双重染色和荧光最大的区别是不需要合并(合并)图片，肉眼就能发现两种蛋白质的色差，而且可以永久保存，不用担心信号退化。

双重染色类似于传统的组织染色过程，使用相同的显色方法和试剂，但实际上在同一个样品中呈现两种不同颜色的蛋白质并不是那么容易的，其中封闭缓冲液、底物、抗体等试剂都有深刻的知识。例如，在抗原提呈系统中，必须避免含有磷酸根的试剂，以减少信号干扰。

图1:右边是人视网膜内皮细胞的免疫组织化学染色，左边是人扁桃体的免疫染色。

阻塞

在双重染色中，必须特别注意阻断步骤，以避免非特异性结合信号干扰，尤其是当二抗(二抗)识别一抗(一抗)时，往往会出现噪声干扰，因此阻断步骤更为重要。除此之外，封口也是降低背景值的关键。高背景值往往是IHC会遇到的问题，其干扰信号源主要是由组织内内源酶或抗体Fc端非特异性结合引起的。

在双染实验下，可以选择不同的显色体系，但通常选择相同的显色体系，只需要不同的颜色。但由于都是同一个系统，合适的阻断缓冲液和高特异性的抗体是重要的课题，根据不同的需要选择合适的阻断更为重要。

阻断/灭活酶

内源性过氧化物酶、磷酸酶和底物的结合是背景值高的主要原因，有效抑制过氧化物酶和磷酸酶的活性可以降低背景值。

不同的显色体系选择不同的显色剂，左旋咪唑分子能有效抑制磷酸酶活性。但肠道组织中的磷酸酶不受左旋咪唑的抑制，但厂家的一些广谱产品能有效抑制与左旋咪唑拮抗的磷酸酶活性。

其他产物能有效抑制内源过氧化物酶。有实验建议用过氧化氢(H2O2)阻断内源性HRP，但最常见的问题是实验过程中产生的气泡破坏了原有的组织结构。即使溶于甲醇中的H2O2可以改善气泡的产生，也容易导致抗原的破坏，导致单个抗体的结合无法识别。各种因素导致越来越多的研究者选择商用阻断缓冲液。

在双染色IHC实验中，由于将使用两种辣根过氧化物酶标记的抗体，在添加第二种辣根过氧化物酶标记的抗体之前，需要确认第一种辣根过氧化物酶标记的抗体的酶活性被失活，以避免残留的辣根过氧化物酶活性影响后续信号。在这种情况下，特别需要在不破坏抗原结构的情况下使第一抗体上的辣根过氧化物酶失活。

阻断一般非特异性结合

通常，为了增加组织的粘附力，对载玻片进行一些表面处理，如聚赖氨酸。然而，虽然这种处理可以增加粘附力，但是它可以容易地在没有组织的区域导致非特异性蛋白质结合。此外，抗体可能与组织形成非特异性结合，这将影响后续的解释。

免疫细胞中的Fcγ受体也可能引起高背景现象，主要是因为FCγ受体对IgG的结合力不同，但对高亲和力和低亲和力的IgG结合力所用的阻断方法也不同。如果低亲和力的FCγ受体在组织内，则不用担心，只要增加清洗剂的培养时间，就可以破坏其键；但如果是高亲和力的FCγ受体，就更难了，因为它对IgG有很强的结合力，所以非特异性结合不能仅用洗涤试剂去除，血清或未标记的IgG可以有效降低特异性结合。10% BSA稀释液/封闭液(# 50-61-00)或10%血清最常用于抑制非特异性结合。少量去污剂的存在，如0.05% Tween20溶解在封闭缓冲液或清洗试剂中，也可以改善非特异性结合的问题。

抗体的选择

免疫染色一直是一个研究趋势，许多抗体公司已经开发出针对IHC的抗体，以迎合市场的需求。除了一级抗体，识别一级抗体的二级抗体是关键。大部分都是多株抗体，最大的好处就是可以增加信号。但多株抗体遇到的最常见问题是不同物种间的交叉再活化，所以即使是二级抗体，也最好是通过不同物种间的血清吸附反应来降低交叉反应性。

为了严格控制二级抗体的质量，一些大型工厂会经过10道纯化工序(图2)，包括阳性筛查IgG，然后通过阴性筛查去除构型相似的IgM或IgA，再进行后续的过滤和包装。这样复杂的程序可以使背景值最小化，特异性和稀释率高。有些抗体会通过血清吸附实验来减少物种交叉反应的发生。相反，如果只使用3-4个纯化程序，很容易产生噪声，往往会影响后续的实验。

图二

生物素化抗体

如果两个一级抗体来自同一个物种，就没有办法用二级抗体做双重染色实验。主要是因为二级抗体是识别一级抗体的物种，如果一级抗体的物种相同，就无法区分哪个抗体是信号。所以如果实验遇到这样的情况，建议在一个初级抗体后面连接生物素。这样就可以通过生物素和链霉亲和素的结合来区分，所以其中一种的二级抗体要选择链霉亲和素与HRP或AP酶连接进行后续的显色实验。如果是这种情况，应该先检测未校准的一级抗体，然后可以防止非特异性结合，再加入另一种校准了生物素的一级抗体。

当然，除了生物素-链霉亲和素法，还有其他的选择，比如选择FITC校准一级抗体，然后选择抗FITC作为二级抗体。

辣根过氧化物酶和过氧化氢酶是IHC最常用的酶。AP系统的优点是可以长时间显示信号，但是过长的显色也会导致背景值过高，一般不建议超过10-20分钟。在双重染色实验中，也可以使用其他合适的产品来抑制内源性辣根过氧化物酶的活性，这可以在不增加背景值的情况下将信号值增加大约两倍。

全抗体对Fab对F(ab’)2

除了全IgG，市面上还有不同同种类型的抗体，比如Fab或F(ab’)2。两者的区别在于两者之间是否存在二硫键。如果样本是淋巴系统或其他免疫系统，F(ab′)2和Fab是很好的选择，它们的分子比较小，很容易穿入福尔马林固定的组织。但是因为它们的制造工艺复杂，抗体的价格会更高。

基材的选择

为了区分不同的目标蛋白，应避免使用相同的颜色体系或吸收光谱。HRP体系常见的底物是DAB，为褐色沉淀。产品非常稳定，适合双染。AP系统没有HRP系统普及。

反染色

复染剂是一种对细胞核进行染色的染色剂，旨在确定细胞的位置。这是一种染色背景值的方法，只要颜色不与其他显色剂重复。当然，这种染色取决于实验要求，不是必要的程序。

【此订阅号为非营利性学术交流订阅号，部分信息来自网络。如果涉及版权问题，请及时联系管理员；所有文章仅供公益交流，不代表本订阅号立场。欢迎大家提供素材，素材等。，提交电子邮件地址是tougao@91360.com。一旦被采纳，稿费就要交了。】