高二化学教案 高中化学教学设计

　　1 引言

　　核苷酸及其衍生物在食品、医学、农业、化妆品、及生化试剂等领域具有十分广泛的用途。尤其在我国核苷酸的需求量很大，但主要依靠进口，在这个方面缺口很大[1]。目前核苷酸的生产工艺不完善，利用酶解法生产核苷酸以及酶解工艺条件的研究，在国内报道的很少，国内吴莉莉等人曾利用双酶法降解核酸，生产呈味核苷酸i+g[2]。杨斌等人也对利用酶解法生产呈味核苷酸的生产进行过论述，但是都未曾对酶解核酸的工艺条件进行过优化摸索工作。

　　目前，对于核苷酸三种主要生产方法相比较而言，酶解法成本低，同时可以生产四种产品，明显优于其他两种生产方法。对于酶解法利用的原料rna，可以从啤酒废酵母中提取，解决了啤酒厂废酵母的出路，做到了资源的再生和利用。再对提取rna的废酵母考虑综合利用，可以产生更大的经济效益和社会效益。虽然酶解法生产四种核苷酸有很大的优越性，但是，该方法中存在着以下几个主要问题:1、原料质量差。目前国内rna的纯度在80%左右，溶解后存在大量的杂蛋白，降低了酶解率。并且由于杂蛋白的存在增加了分离的难度。2、生产的菌株水平低：利用桔青霉作为生产核酸酶p1的菌株，其生产的酶活仅为国外菌株的60%，对rna的酶解率仅为70-85%，国外酶解率可以达到85%-95%。3、离交分离收率低：一方面由于酶解不彻底，存在许多杂质如寡聚核苷酸等，增加了分离难度；另一方面由于分离材料的选择性差，对5’-核苷酸的吸附容量小，不能高效的分离四种核苷酸。4、结晶技术不过关。

　　所以通过rna水解实验的研究，对rna水解条件进一步优化，得出水解rna的最佳工艺，尽可能多的得到单核苷酸，应用在各个领域。

　　1.1 核糖核酸酶

　　1.1.1 概述

　　从20世纪60年代以来，核糖核酸酶作为一种模型蛋白被普遍用于分子生物学研究。核糖核酸酶（rnase）的全名为聚核苷-α-寡核苷酸转移酶，是一类广泛存在于动植物体内的水解核酸链中磷酸二酯键的酶。这些酶对核酸的作用是水解核苷酸残基之间的磷酸二酯键，生成寡聚核苷酸或单核苷酸。rnase的主要生理功能是控制细胞内rna的种类与数量分布，除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程外，还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、宿主的防御机制、控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒复制等有关[3]。

　　1.1.2 核糖核酸酶的分类

　　根据酶作用核酸分子部位的不同，可分为3’-磷酸二酯酶和5’-磷酸二酯酶。根据反应的最适ph不同分为酸性核糖核酸酶和碱性核糖核酸酶。酸性核糖核酸酶主要存在于细胞的溶酶体中，水解所吞噬的异物中的rna；碱性核糖核酸酶存在于胞液中，水解胞液中的rna。根据降解rna底物的不同一般分为3类：rnaseⅰ既能催化rna 水解，又可催化dna水解，产生5’-单核低聚核糖核苷酸或5’-单核低聚脱氧核糖核苷酸；rnaseⅱ仅使rna释放2’、3’环状嘌呤核糖核苷酸和3’-嘌呤核糖核苷酸；rnaseⅲ只水解rna释放2’、3’环状嘌呤或嘧啶核糖核苷酸和3’-嘌呤或嘧啶核糖核苷酸。根据酶作用的专一性[2]可分为核酸外切酶①蛇毒磷酸二酯酶：从毒蛇的毒液中提取的，它从核酸的单链的3’-oh端开始水解，生成5’-单核苷酸，该酶的最适ph为9，ca2+和mg2+为激活剂，还原剂和螯合剂抑制酶活力；②脾磷酸二酯酶：从牛脾中提取的，水解产物为3’-单核苷酸。核酸内切酶：核酸酶s1从米曲霉菌中提取出来的单链专一性内切酶，产生5’-单核苷酸，最适ph为4.5-5.0，需要zn2+、co2+也可刺激酶活力，但mg2+、ca2+、cu2+无效。该酶对热较稳定，底物存在时于65℃保温不失活。内切兼外切酶：核酸酶p1从桔青霉制得的，故又称桔青5’-磷酸二酯酶，纯化的p1酶对单链专一；最适温度70℃，最适ph5；zn2+为激活剂。8mol/l的尿素和5mol/l的盐酸胍可抑制酶的活性。核酸酶p1酶还具有3’-磷酸单酯酶的活性，可水解3’-单核苷酸、核苷二磷酸、和3’-二核苷酸的3’磷酸键，核酸酶p1酶常常用于制备5’-单核苷酸。

　　1.6.2 本文的主要内容

　　1.6.2.1 麦芽根中核酸酶的提取

　　① 研究在不同加水比、ph值、温度、时间等条件下酶的活力大小。

　　② 酶活的测定，采用紫外分光光度计法。

　　1.6.2.2 水解rna条件的研究

　　① 用从麦芽根中提取的核酸酶水解rna，研究不同底物浓度、加酶量、ph值、温度、时间等条件下水解率的高低。

　　② 用发酵酶液水解rna，研究不同因素水平下水解率的高低。

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