ELISPOT(Enzyme-linked Immunospot Assay)全名为酶联免疫斑点检测,结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术,能够检测到单个细胞分泌的细胞因子情况。简单来说,就是用包被好的抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子,并以酶联斑点显色的方式将其呈现出来。

ELISPOT 实验原理

ELISPOT 实验使用 PVDF 膜为底的 96 孔板(cat:MSIPS4510,Millipore),包被上特异性的单克隆抗体(需要无毒,不含内毒素,亲和力高的抗体),以捕获细胞分泌的细胞因子。

然后在培养板的孔内加入待检测的细胞和抗原刺激物进行培养。在刺激物的刺激下,T 细胞就会在对应的时间段分泌对应的细胞因子。此时细胞因子就被包被在膜上的抗体所捕获。

洗去细胞后,被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合,然后用酶标亲和素与生物素结合,进行化学酶联显色,就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点(当然,也可以使用荧光素标记的第二抗体,这样就省去了后续的化学显色方法,并且一次可以检测多种细胞因子),每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞。

统计膜上的斑点的数目,再除以当初加入孔内的细胞总数,就可以计算出阳性细胞的百分比。

该技术有以下三大优点:

一:灵敏度高。一百万个细胞中只要有一个细胞分泌细胞因子就可被检测出来,相对于传统的 ELISA 方法提升了 2~3 个数量级。

二:单细胞水平,活细胞功能检测。ELISPOT 是用抗原直接刺激活细胞,检测的是活细胞的功能。

三:操作简便经济,可进行高通量筛选。ELISPOT 没有复杂的细胞体外扩增过程,不使用同位素,按照标准化的实验操作,一个实验者可以同时处理数百个样品,效率远远高于其它检测方法。

以上只是 ELISPOT 的原理,下面直接上干货:标准 protocol。

综合了 nature protocol(Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays),CTL,mabtech 和其他若干 paper 的经验,写下了这篇标准 protocol,一步步走向成功。

以检测 IFN-γ 为例,本人已经做了 20 多次,屡试不爽,先 show 几张图吧:

ELISPOT 实验步骤

准备实验,建立好 plate 布局,至少用 3 个复孔来测试每一个条件,用 4~6 个复孔来优化阴性对照。

第 1 天

A. 准备 ELISPOT plate(需要无菌条件)

1. 使用无菌的 pH 7.4 的无钙镁离子的 1 × PBS(即 DPBS)(0.22 μm 滤器过滤)稀释包被抗体(cat:3420-2H,Mabtech)(1-D1K:1 mg/ml)至 15 μg/ml(1.5 μg/100 μl)。

2. 取出 Millipore 96-well PVDF ELISPOT plate(cat:MSIPS4510,Millipore),每孔加入 15 μl 35% 乙醇处理 2 min。

3. 无菌水(0.22 μm 滤器过滤)清洗 plate 5 遍,每次每孔加入 200 μl。

4. 最后一遍弃掉液体后,轻轻在无菌纸上扣干(注意:一定要轻,以防损伤 PVDF 膜)。

5. 每孔加入 100 μl 步骤 1 稀释的 1-D1K 抗体溶液,4~8 ℃ 孵育过夜。

第 2 天

B. 在 plate 中培养细胞(需要无菌条件)

6. 准备细胞。

如果是液氮冻存的细胞,复苏后计数,然后在 37 ℃,5% CO2条件下使得细胞恢复以达到一个较高的密度。

注意:culture medium 中的 serum 要预测试其合适性,因为 serum 的选择极大影响背景反应水平和细胞的总体反应。

7. 准备刺激物。

ELISPOT 实验应该有的 control:

Con1:只有细胞 cell alone for background reactivity。

Con2:只有培养基 medium alone for false positive spots。

Con3:细胞和丝裂原(如 PHA)cell plus motigen for overall assay functionality。

Con4:细胞和对照多肽库 cell plus control peptide pool for internal sample control。

Con5:外部趋势对照,1~2 个参照样品用以测试培养基,对照抗原和丝裂原 external trending control, typically consisting of 1–2 reference samples tested against medium alone, a control antigen (e.g., peptide pool against which those samples exhibit a detectable response) and mitogen。

Positive control:CEF peptide pool 和 PHA 刺激。

CEF peptide pool(cat:PM-CEF-E,JPT):先用纯的 DMSO(40 μl)溶解,再用 1 × PBS 稀释到终浓度,DMSO 的终浓度必须小于 1%,以免细胞毒性。

PHA:先加 1 ml 无菌的 DPBS 或者细胞培养基到 5 mg 的 PHA 凝集素中,轻轻混匀溶解,使用之前再用无菌的 buffer 稀释到所需的工作液浓度。注意不要过滤以免损失。

CEF peptide pool 和 PHA 要稀释到 2 × 的终浓度。

Negative control:培养基 +DMSO,DMSO 浓度和 CEF peptide pool 中终浓度一致。

8. 去除 plate 中的抗体,无菌 PBS 清洗 plate 5 遍,每次每孔 200 μl。

9. 最后一遍弃掉液体后,轻轻在无菌纸上扣干。

10. 封闭 plate:每孔加入 200 μl 1% BSA(0.22 μm 滤器过滤),室温孵育至少 30 min。

11. 去除封闭液,加入 50 μl CEF peptide pool,PHA,阴性对照和刺激物到合适的孔中。

12. Gently 铺板细胞,每孔 50 μl culture medium,2~4 × 105 cell/ml(具体的细胞数目需要做梯度摸索),轻拍板的边缘使得细胞均匀铺开,然后放入培养箱,37 ℃,5% CO2培养 16~20 h。

注意 1:步骤 11 和 步骤 12 可以合为一步,即先把细胞和刺激物混匀后再加入对应的孔中。

注意 2:培养期间不要移动 plate,并且采取措施防止蒸发,可以使用铝箔纸包裹 plate。

第 3 天

13. 去除 plate well 中的细胞,然后用 PBS+ 0.05% Tween-20 清洗 well 4~6 遍以完全去除细胞,每次 200 μl。

注意:细胞去除不完全会破坏 spot 的形成。

14. 用 0.5% BSA in 1 × PBS 或者 0.5% FCS(胎牛血清)in 1 × PBS 稀释生物素标记的检测抗体 7-B6-1-biotin 至 1 μg/ml,再用 0.22 μm 低蛋白结合的滤器过滤,然后每孔加入 100 μl,37 ℃ 孵育至少 2 h。

15. 清洗 plate well,参考步骤 3(第 2 天)。

16. 用 0.5% BSA in 1 × PBS 或者 0.5% FCS(胎牛血清)in 1 × PBS 稀释链霉亲和素 -HRP(streptavidin-HRP),每孔加入 100 μl,室温孵育至少 1 h。

注意 1:根据显色底物来决定过氧化物酶结合物(peroxidase conjugate)的稀释度。 底物为 AEC,推荐 1:100 稀释度。底物为 TMB,推荐 1:500~1:1000 稀释度。

注意 2:HRP 结合物(HRP-conjugates)不能在含有叠氮化钠的 buffer 中使用,因为叠氮化钠会抑制酶的活性。

17. 使用 1 × PBS 清洗 plate well 4~6 遍,每次 200 μl。

注意:不要使用带有 Tween-20 的 washing buffer,因为 Tween-20 会干扰 spot 的形成。

18. 加入底物 TMB,每孔 100 μl,直至清晰的 spots 出现。

注意:底物 AEC/TMB 稀释后要用 0.45 μm 滤膜过滤。

19. 用去离子水来终止显色反应。

20. 去除 plate underdrain 上所有多余的液体,用纸巾将孔的背部彻底擦干。

注意:残留的底物会引起孔中的色斑。

21. plate 在黑暗环境中过夜,彻底晾干。

22. 使用 ELISPOT reader 观察计数。

ELISPOT reader 使用方法

读板

1. 开机:先开 ELISPOT reader,再开电脑。

2. 选择 CTL。

3. 选择扫描软件,即 capture。

4. 进入扫描向导模式,选择 plate 类型,MSIP45。

5. 选择保存路径,可以修改。

6. 点击 eject,弹出载物台,放好 plate。

注意:板子的 A1 孔要和载物台的 A1 位置对准,然后在弹出的对话框中命名,点击 load。

7. 点击 Preselect Wells,可以选择列-column,行-row,单孔-single。

8. 修改曝光时间:退出向导,点击 preference,这里有仪器的全部设置。点击 image capture setting,在 exposure setting 里,勾选 modify exposure time,然后可以修改曝光时间。

9. 选择 auto center for each well,即相机镜头自动对准样品孔。

10. 点击 start,开始读板。

分析

1. 点击分析软件。

2. 进入选择界面。左边一栏:选择斑点类型,Normal:背景比较干净的;Normal diffuse:斑点弥散,有点背景的;中间一栏:counting module,一般选择智能计数—smart count;右边一栏:质控-quality control。

3. 点击 Smart count。

① 选择板子—load plate

② 定义计数参数—define counting parameter

测试斑点识别的精度,即双击需要识别的孔即可。

斑点识别的是否精确,否的话需要调节参数,Diffuse processing,有 small,large 等可选;在出现白斑的情况下勾选 fill holes 选项;调大 spot separation 可以使连接的斑点分离;勾选 hair removal 可以去除头发丝状杂质;调小 count area 可以去掉已经选中的孔边缘深色非斑点部分;勾选 normalize counts 可以根据斑点的平均分布估算红圈外未选中区域的斑点个数,未勾选则完全删除红圈外的斑点个数,数字后会有一个 *,* 代表有估算的内容在内。

点击 BACK,回到原来界面。

测试斑点识别的精度,即双击需要识别的孔即可。

斑点识别的是否精确,否的话需要调节参数,Diffuse processing,有 small,large 等可选;在出现白斑的情况下勾选 fill holes 选项;调大 spot separation 可以使连接的斑点分离;勾选 hair removal 可以去除头发丝状杂质;调小 count area 可以去掉已经选中的孔边缘深色非斑点部分;勾选 normalize counts 可以根据斑点的平均分布估算红圈外未选中区域的斑点个数,未勾选则完全删除红圈外的斑点个数,数字后会有一个 *,* 代表有估算的内容在内。

点击 BACK,回到原来界面。

③ 设置阈值-gating

收集阳性孔斑点—collect POS Wells,点击阳性孔,孔上会出现 P 的标记,然后点击 finish。

收集阴性孔斑点—collect Neg Wells,点击阴性孔,孔上会出现 N 的标记,然后点击 finish。

点击 auto-adjust,机器会自动设置阈值。如果阴性孔没有斑点,直接在阳性孔上调节阈值。白色圆圈代表非特异性斑点,其大小在最小阈值以下。

点击 start autocount,开始计数。

收集阳性孔斑点—collect POS Wells,点击阳性孔,孔上会出现 P 的标记,然后点击 finish。

收集阴性孔斑点—collect Neg Wells,点击阴性孔,孔上会出现 N 的标记,然后点击 finish。

点击 auto-adjust,机器会自动设置阈值。如果阴性孔没有斑点,直接在阳性孔上调节阈值。白色圆圈代表非特异性斑点,其大小在最小阈值以下。

点击 start autocount,开始计数。

质控

1. 点击质控—quality control。

2. 点击 add plates,选择添加板子后,观察板子状态,如果为计数,则状态为 scan,如果已经计过数,则状态为 counted。

3. 点击 start,开始质控。

4. 处理有问题的孔,最好每个孔都看一遍。

5. 双击要处理的孔。

① 降低灵敏度,然后点击 count,可以去除一些杂质。

注意:调节灵敏度会使一些颜色较浅的信号斑点消失。

② 删除斑点:高级设置 advanced setting—去除斑点 audit spots,然后点击 count,双击选中的杂质斑点,右击选择 YES 即可删除杂质斑点。删除的斑点系统自动用黑色圆圈圈上。

③ 删除区域:高级设置 advanced setting—手动模式 manual mode,然后点击 count,这时可以画圈选取不想要的区域,然后右击闭合,即可选中。

点击 manual mode 旁边的 setting,可以在 manual 中选中 normalize,ignore 等选项,normalize 即选圈中的部分仍然技术,ignore 则为忽略不计数。

④ zero:适用于全部阴性孔,可全部删除杂质。

⑤ TNTC:too numerous to count,即斑点太多而无法计数,需要下次实验调整细胞数目。

6. 点击 finish to next plate 即完成一块板子。

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文章来源:杨果

配图来源:杨果

题图来源:视觉中国

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