百合地黄汤 经典名方百合地黄汤物质基准制备及过程质量控制研究

目的制定百合地黄汤的原料标准，分析其制备工艺和质量控制，评价其科学性和合理性。方法按古书法制备15批物质，在制备过程中测定梓醇和毛蕊花糖苷的含量，计算转移率和得膏率，建立高效液相色谱指纹图谱检测方法，分别检测饮片、汤剂、浓缩液和对照品的指纹图谱，并对共有色谱峰进行归属、鉴别和相似性评价。结果15批梓醇和毛蕊花糖苷的转移率分别为81.40% ~ 92.88%和28.90% ~ 41.41%，得膏率为36.06% ~ 41.71%，无离散数据。有效成分在煎煮、浓缩和冷冻干燥过程中的转移率稳定。校准品标准指纹图谱共有16个峰，其中百合6个，地黄9个，鉴定出3个色谱峰。饮片、汤剂、浓缩液和物质的标准指纹图谱相似度大于0.9；汤剂、浓缩液和物质标准品的参考图谱相似度大于0.99。结论指纹图谱检测方法合理可行，可同时应用于饮片、中间体和物质标准。参考资料的编制过程科学合理，不会对其物质基础造成明显变化。本实验为百合地黄汤的开发奠定了基础，为经典名方药材的标准制备工艺和质量评价提供了新思路。

百合地黄汤(BDD)出自东汉张仲景《金匮要略》。全方有百合、滋阴润肺、清心安神两味，与地黄配伍清热凉血、滋阴生津。它具有滋阴清热、补益心肺的作用，主治百合病的心肺阴虚和内热，百合病与现代神经精神疾病相似，主要表现为恍惚、神志不清、舌红、尿黄等。现阶段，BDD及其加减方常用于各类抑郁症的临床治疗，疗效显著，安全性高[4-7]，其抗抑郁机制可能与抑制单胺氧化酶活性、调节HPA轴功能障碍有关[8-9]。

经典方剂有着悠久而丰富的用药历史。BDD作为经典方剂，仍然具有很好的临床价值。2018年5月，国家药品监督管理局颁布了《经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》，提出了“物质标准”，即用于衡量制剂是否与中医临床使用的药材一致的中药药材标准。经典名方复方制剂的所有药学研究必须与物质标准进行比较，以确保与物质标准的关键质量属性相一致。因此，科学合理地评价BDD物质基准的制备工艺是BDD制剂发展的重点和难点。本实验根据古籍记载的煎煮方法，随机选取道地产区的15批百合、地黄饮片，进行煎煮-浓缩-干燥工艺研究。同时建立指纹图谱检测方法，结合有效成分转移率、膏体得率等技术指标进行全过程的质量评价和分析，为BDD制剂的开发奠定基础。

1.1仪器

沃特世e2695高效液相色谱仪，沃特世公司，美国；安捷伦1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；XS205DU电子分析天平(精度0.01 mg/0.1 mg)，XS204电子分析天平(精度0.1 mg)，瑞士梅特勒-托利多；上海东富隆科技有限公司LYO-1冷冻干燥机；PCDX-JB-10超纯水机，成都品诚科技有限公司

1.2试剂

乙腈为色谱纯，美国费希尔公司；水是超纯水，自己做的；其他试剂是分析纯的。对照品毛蕊花糖苷(批号11530-201713，质量分数92.5%)和梓醇(批号110808-201711，质量分数99.6%)购自中国食品药品监督管理局研究院。对照品异毛蕊花糖苷(批号PCL-#-Ve635，质量分数99.47%)和地黄(PCL-#- Ma982，质量分数98.0%)均购自英国PureChem Land公司。

15批百合和地黄购自三个不同的地方，由四川省药品检验所总药师李月成鉴定。它们是百合的干燥肉质鳞片。百合科的青霉菌和玄参科的鲜或干块茎。加工了15批百合片和地黄片，具体信息见表1。经检验，药材及饮片的水分、浸出物、含量均符合《中国药典》(2015年版)2.1饮片含量的测定的有关规定。

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根据中国药典2015年版“地黄”项下的含量测定方法，测定了地黄饮片中梓醇和毛蕊花糖苷的含量，结果见表2。

2.2 BDD参考材料的制备[12-14]

称取30克百合切片放入烧杯中，加入400毫升水，浸泡30分钟，在电炉中加热，保持沸腾50分钟，煎煮至200毫升左右，过滤，得到百合汤。在烧杯中称取地黄饮片30克，加入9倍水，浸泡30分钟，在电炉中加热至沸腾，保持沸腾20分钟，过滤；向残渣中加入7倍量的水，加热至沸腾，保持沸腾15分钟，过滤，合并两次滤液，约200毫升，得到地黄煎剂。将上述两种煎液合并，煎至300毫升，得BDD煎液。将200毫升煎煮液减压浓缩至40克左右，定容至50毫升，得到浓缩液，冷冻干燥，得到BDD物质标准品。

2.3在制备参考材料的过程中测定活性成分的含量和糊状物的产率

2.3.1梓醇含量的测定

(1)色谱条件:采用Agilent1260高效液相色谱仪和Ultimate LP-C18(250 mm×4.6 mm，色谱柱)。流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(1∶99)。进样量为10μl；检测波长为210纳米；。柱温30℃；由catalpol峰计算的理论塔板数不小于5 000。

(2)对照品溶液的制备:取适量梓醇对照品，准确称量，加入流动相，制成含梓醇100μg/mL的溶液。

(3)供试品溶液的制备:(1)煎煮液:准确量取1毫升BDD煎煮液，放入10毫升容量瓶中，向刻度中加入流动相，摇匀，过滤，取滤液。②浓缩液:准确量取1mL BDD浓缩液，放入50 mL容量瓶中，将流动相加入刻度，摇匀，过滤，收集滤液。③材料标准:取BDD材料标准0.7 g左右，准确称量，放入100 mL容量瓶中，加入80 mL流动相(功率500 W，频率40khz)使其溶解10min，取出，冷却，定容至刻度，摇匀，过滤，取滤液。

(4)方法学考察:结果表明，该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性；线性回归方程为y = 2.4368x+11.783，r = 0.999 9。梓醇在7.93 ~ 507.71 μ g/ml范围内线性关系良好，加标回收率为96.8% ~ 100.5%，相对标准偏差为2。

(5)样品测定:测定供试品溶液中梓醇的含量，计算转移率(转移率=样品中的梓醇/饮片中的梓醇)。结果如表2和表3所示。

2.3.2毛蕊花糖苷含量的测定

(1)色谱条件:采用Waters e2695高效液相色谱仪和Xsele HSS T3(250mm×4.6mm，5微米)柱。流动相为乙腈-0.1%乙酸水溶液(16∶84)。样品进样量为20μl；检测波长为334纳米；。柱温30℃；根据毛蕊花糖苷的峰计算，理论塔板数不小于5 000。

(2)对照品溶液的制备:取适量毛蕊花糖苷对照品，精确称量，加入流动相，制成含有10 μg/mL毛蕊花糖苷的溶液。

(3)供试品溶液的制备:(1)煎煮液:准确量取2毫升BDD煎煮液，放入10毫升容量瓶中，向刻度中加入流动相，摇匀，过滤，取滤液。②浓缩液:准确量取1mL BDD浓缩液，放入25 mL容量瓶中，将流动相加入刻度，摇匀，过滤，收集滤液。③材料标准:取BDD材料标准0.7 g左右，准确称量，放入50 mL容量瓶中，加入35 mL流动相(功率500 W，频率40khz)使其溶解10min，取出，冷却，定容至刻度，摇匀，过滤，取滤液。

(4)方法学考察:结果表明，该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性；线性回归方程为y = 36.249X-9.7553，r = 1.000。毛蕊花糖苷浓度与毛蕊花糖苷峰面积的线性关系为1.53 ~ 192.03μ g/ml，回收率为97.9% ~ 103.0%

(5)样品测定:测定供试品溶液中毛蕊花糖苷的含量，计算转移率(转移率=样品中毛蕊花糖苷的量/饮片中毛蕊花糖苷的量)。结果如表2和表3所示。

2.3.3出膏率的测定:测定15批物料的基准出膏率(出膏率=物料基准干膏质量/饮片投料量)，结果见表3。

结果表明，梓醇和毛蕊花糖苷的平均含量分别为1.77%和0.128%，相对标准偏差分别为5.64%和7.52%，表明不同产地地黄的有效成分含量差异不显著。

梓醇的平均转移率分别为88.57%、87.79%和87.20%，相对标准偏差分别为5.71%、4.47%和3.35%。毛蕊花糖苷的平均转移率分别为35.15%、34.57%和34.26%，相对标准偏差分别为12.37%、11.69%和11.39%。由于提取溶剂为水，梓醇极性强，转移率高，毛蕊花糖苷极性弱，转移率低；考虑到地黄饮片中毛蕊花糖苷含量较低，其转移率的波动基本可以接受，说明煎煮、浓缩、冻干工艺稳定，有效成分无明显损失。

15批梓醇和毛蕊花糖苷的平均质量分数分别为2.15%、0.060%，相对标准偏差分别为4.90%、8.31%，平均得膏率为38.39%，相对标准偏差为4.18%，无离散数据(平均值~ 130%除外)[15]，说明制备工艺合理，未造成明显不良反应

2.4高效液相色谱指纹图谱分析

2.4.1测试溶液的制备

(1)试片液:分别取百合汤、地黄汤，加水定容300 mL，摇匀，滤过，取滤液。

(2)煎煮:取BDD煎液，摇匀，滤过，取滤液。

(3)浓缩液:准确量取2毫升浓缩液，放入10毫升容量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，取滤液。

(4)材料标准:取干粉0.7 g，放入10 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，摇匀，过滤，取滤液。

2.4.2混合参比液的制备:取适量的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、瑞香宁等参比物质，精确称量，加入流动相，制备含有毛蕊花糖苷16 μg/mL、异毛蕊花糖苷35 μg/mL、瑞香宁4 μg/mL的混合参比液。

2.4.3色谱条件和系统适应性试验色谱柱为Waters对称C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱:0 ~ 10分钟，乙腈~ 11%；10 ~ 25分钟，11% ~ 12%乙腈；25 ~ 37分钟，12%乙腈；37 ~ 44 min，12% ~ 16%乙腈；44 ~ 50分钟，16% ~ 18%乙腈；50 ~ 53分钟，18% ~ 22%乙腈；53 ~ 58分钟，22% ~ 24%乙腈；58 ~ 65分钟，24% ~ 36%乙腈；65 ~ 68 min，36% ~ 42%乙腈；检测波长为315纳米；。体积流量为1.0毫升/分钟；柱温30℃；样品注射量为30微升..准确吸取30μL空白色溶液、混合参比溶液和物质参比供试品溶液，注入液相色谱仪，测量并记录色谱图。结果见图1。

2.4.4为进行精密度考察，取同一物质的参比供试品溶液(批号BDDWZJZ011)，按“2.4.3”中的色谱条件连续进样6次，并记录色谱图。以异毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差分别为< 0.43%和< 1.83%，表明仪器的精密度良好[13]。

2.4.5稳定性考察:取同一物质的参比供试品溶液(批号BDDWZJZ011)，按照“2.4.3”中的色谱条件，在0、2、4、8、12、24 h进样测定，并记录色谱图。以异毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰，计算出相对保留时间RSD < 1.11%和相对峰面积RSD < 4.43%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.4.6重复调查，并行制备6种对照品(批号BDDWZJZ011)，根据“2.4.3”下的色谱条件进行测定，并记录色谱图。以异毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差分别为< 0.61%和< 4.58%，表明该方法具有良好的重复性。

2.4.7样品检测和分析:取15批百合片、地黄片、BDD汤剂、浓缩液和对照品，按照“2.4.1”下的方法配制供试品溶液，按照“2.4.3”下的色谱条件进行测定，并记录色谱图。将样品色谱引入中药指纹图谱相似性评价系统软件(国家药典委员会，2012A)，采用时间窗为0.1分钟的平均法进行峰匹配和相似性分析，结果见图2和表4、5。

结果表明，15批物质的标准指纹图谱共有16个共有峰，其中6个色谱峰(峰4 ~ 6、9、10、12)属于百合切片，占百合切片总峰面积的85.11%。

占参考物质总峰面积52.44%；九个色谱峰(峰2、3、7、8、11、13 ~ 16)属于地黄饮片，占地黄饮片总峰面积的74.03%，占总物质标准峰面积的37.67%。色谱峰11、13和15分别鉴定为毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和洋地黄苷。结果表明，BDD物质标准的主要物质组可以清晰地追溯到饮片，并明确属于饮片。选择分辨率较高的异毛蕊花糖苷色谱峰作为对照峰，所有共有峰的相对保留时间相对标准偏差小于0.42%，相对峰面积相对标准偏差为15.29% ~ 70.41%。

15批百合片、地黄片、汤剂、浓缩液和物质的参考指纹图谱与各自对照指纹图谱的相似度> 0.9。结果表明，不同产地不同批次饮片的主要物质组差异较小；汤剂、浓缩液和物质标准的物质组相对稳定，说明煎煮、浓缩和干燥工艺科学合理。汤剂、浓缩液和物质标准品的参考图谱相似度均> 0.99，所有共有峰的相对保留时间基本相同，相对峰面积无明显变化。可以看出，在物质标准的制备过程中，主要物质组可以从饮片-汤剂-浓缩液-物质标准逐步转移，浓缩干燥过程不会造成主要物质组峰面积的明显损失，说明物质标准制备的整个过程是科学合理的。

3.1材料标准编制过程的合理性

《金匮要略》BDD原方为“百合(七片，碎)，生地黄汁(一升)；右边，用清水洗净百合，染一夜。白沫一出，水就出来了，泉水两升。炸一升，去渣，大陆的黄汁，炸一升，不同温度服用。”据考证，方子中的“一升”在近代约为200 mL，“五合”在近代约为100mL[16]。配方中的生地黄汁是蒸鲜地黄后的磨汁[17]。由于其加工方法复杂，在现代临床上很少使用，课题组前期研究发现鲜地黄汁和生地黄汤的物质基础基本相同，所以用生地黄汤代替鲜地黄汁入药。处方中百合、地黄的用量是通过古书考证，结合现代中医临床使用，经专家共识得出的。

在本实验中，在BDD对照品的制备工艺研究中，我们始终以古籍记载的煎煮方法为基础，以饮片-煎煮液-浓缩液-对照品中主要物质组的价值传递关系为核心[18]，以有效成分的转移率、膏体收率等技术经济指标为支撑，开展制备工艺的工艺和质量控制研究，以保证制备工艺的科学性和对照品的批次质量一致性和可追溯性。

3.2指数成分的选择

发现BDD含有百合苷、闽江百合苷D、谷氨酸、腺苷、多糖等多种活性成分[19-20]，百合中的活性成分主要为甾体皂苷和多糖，地黄中的活性成分为梓醇、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和多糖[21-23]。本实验以梓醇和毛蕊花糖苷为指标成分，将物质标准的质量控制与活性联系起来。在实验的后期，将采用紫外-可见分光光度法对原料标准中百合皂苷和总多糖的质量控制进行研究，从而更全面地控制BDD原料标准的质量。

3.3指纹条件的调查

实验中比较了不同厂家(沃特世、岛津、安捷伦)色谱柱的分离效果，并对流动相、柱温、体积流量等色谱条件进行了反复考察。根据色谱峰的数目、形状和分辨率，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。二极管阵列检测器(DAD检测器)用于在全波长下扫描物质参考测试溶液，分析三维色谱图，并比较210、230、280、315和334纳米处的色谱图。结果表明，315 nm处有多个色谱峰，响应值高，因此采用315 nm作为检测波长。

3.4指纹相似性评估和分析

15批物质基准指纹图谱共有峰的相对峰面积差异较大，主要是因为三个产地的百合饮片含量差异较大，百合饮片总峰面积为隆回县>武冈市>万载县。因此，在经典名方等中药新药的研发中，首先要控制原药材质量的均匀性。如果药材的质量因产地不同而差异很大，我们可以确定产地或控制药材的含量限制范围。在生产中，可以采用均质和饮片投料的方法来控制中成药质量的均匀性和稳定性，以保证其临床疗效的稳定发展。

3.5应用

本实验建立了一种适用于中药饮片、中间体和物质标准的指纹图谱检测方法。该方法合理可行，重现性好，能充分显示饮片和物质标准中的主要物质组。材料参考的整个制备过程科学合理，工艺技术不会对其材料基础造成明显变化。制备的对照品质量稳定，批次间差异小，为BDD复方制剂的开发和一致性评价奠定了基础，也为经典名优对照品制备工艺的工艺和质量评价提供了新思路。

来源:、林美思、王琳、李锐、、、林、曹科。引用该论文王志平，王志平，王志平，王志平.中草药，2019，50(16):3824-3832。