fitc 如果不了解GFP、FITC和PE的这些特性，你的流式数据就可能是错的

我们在学习荧光的时候，首先学习的是荧光素吸收光子后会释放出波长更高的光子。这个特性叫做斯托克斯位移。

【流媒体中文网注意事项】

斯托克斯在1852年阐明了荧光发射的机制。激发峰和发射峰的波长之差是代表分子发光特性的物理常数，这个常数叫做斯托克斯位移。它代表分子回到基态之前激发态寿命期间的能量消耗。

荧光光谱从相应的吸收光谱红移，这被称为斯托克斯位移。荧光光谱在短波方向的位移称为反斯托克斯位移。

由于光子被荧光分子吸收，分子振动移动时会损失一部分能量，所以最终释放的能量会小于吸收的能量。因为波长与能量成反比，释放的能量越低，波长越长。

因此，检查荧光分子的激发和发射波长非常重要。下图(图1)显示了FITC荧光素在488纳米激发光下的激发和发射波长分布:

图1。FITC的最大发射波长约为530纳米，这意味着如果FITC被激发，它很可能发射绿色光子。因此，我们在流式细胞仪上选择适合这个波长区域的带通滤波器(如525/30)来捕获这些绿色光子。

然而，FITC的发射不限于绿色光子，它也可能发射黄色、橙色和红色光子，尽管概率很低。

如果仔细观察上面的激发和发射曲线，会看到一些奇怪的现象，即在发射曲线上，有少量光子的发射波长甚至低于激发波长(即488nm左侧的绿峰，虽然比例很低)，这意味着释放的光子比激发的光子能量更高？如果是，说明释放的能量高于荧光素吸收的能量。这不是违反能量守恒定律吗？

PE可以被两个波段的光激发，如图2所示，图2下面的第二个波段的光谱分布更清楚地表明了这种异常现象。

图2。FITC对聚乙烯的激发更为复杂，它有两个激发最大值:一个在约488纳米，另一个在约561纳米。有趣的是，当在561纳米激发时，一些发射光子的能量高于吸收光子的能量，这比FITC现象更明显。

如何在不违反相当成熟的一般规律的情况下完美解释这种奇怪的现象？

答案很简单:荧光分子本身提供一些能量。

见霍华德·夏皮罗实用流式细胞术第113页:

嗯，你可能会说激发光谱和发射光谱重叠，也就是说无论用什么波长的光在重叠区域激发，都有可能获得更高能量的光子(比如510nm激发获得一些500nm光子)，这显然违反了能量守恒定律。的确，如果荧光素分子在510nm光子激发荧光素之前就已经处于振动激发态，那么我们真的可以从510nm激发中得到500nm光子，其中分子本身提供的能量导致了这种奇怪的现象。

在这里，你会明白，这种奇怪的、经常被误解的现象是真实存在的，更重要的是，它并不违反物理定律。

当同时检测到FITC和PE时，你会注意到，如果使用宽带滤波器(例如，525/50 BP而不是525/30 BP)，这种现象尤其明显。在FITC光电倍增管中看到的任何PE信号都与激光无关，也就是说，无论你用488纳米激光还是561纳米激光激发，都可以看到这些奇怪的现象。

注:上述由低能向高能转移的现象(反斯托克位移)只发生在488/561共轭系统中，其中两个激光器的发射光通过同一光路被收集。

事实上，如果你在561纳米激发，你会在FITC看到更多的聚乙烯信号，因为561纳米的聚乙烯分子的激发效率高于488纳米。最重要的是发射曲线的形状与激发波长无关。

所以“荧光素发射的光子波长肯定比荧光素吸收的波长长”的说法是错误的，更准确的说法是“荧光素根据发射光谱发射光子，发射光的最大值会向高波长位置移动，大于激发光的最大值”。今天这里提到的现象提醒我们，荧光素远比我们想象的要复杂，但其实也是一件很有趣的事情。注意手中流式细胞仪的光路设计很重要。

参考资源:

1.蓝光荧光光谱仪的波长光谱数据

2.实用流式细胞术。新泽西州霍博肯:约翰威利& amp儿子们。2003.

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