westernblot 知识分享：WesternBlot实验方法及注意事项

实验原理:

WesternBlot法，也称为免疫印迹法，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从获得的蛋白质样品中分离不同分子量的蛋白质，通过转移电泳将从凝胶中分离的蛋白质转移到固体支持物(NC膜或PVDF膜)上，并使用针对目标蛋白质的未标记抗体(一级抗体)特异性结合转移膜上的目标蛋白质，然后结合辣根过氧化物酶标记(偶联)的二级抗体。如果转印膜中含有目标蛋白，曝光显影后X射线胶片上会出现特定的蛋白带。

实验材料:

分离胶和复膜胶液、水饱和异丁醇、1× tris Cl/SDS、pH 8.8、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置和夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲罐等附件、0.75mm边缘密封垫、0.75mm样品梳、50μl微量进样器和恒流电源

常用试剂:

1)30%丙烯酰胺/0.8% N，N’-亚甲基丙烯酰胺

将30克丙烯酰胺和0.8克N，N’-亚甲基丙烯酰胺溶于总体积为60毫升的水中，加热至37℃溶解，加水至最终体积为100毫升。0.45μm微孔滤膜灭菌，验证溶液的pH值应不大于7.0，保存在棕色瓶中。

注意:丙烯酰胺有很强的神经毒性，可以通过皮肤吸收，作用是累积的。称丙烯酰胺和N，N’-亚甲基丙烯酰胺时，应戴手套和口罩。聚丙烯酰胺可以被认为是无毒的，但应该小心处理，因为它可能还含有少量未聚合的物质。

2)4×Tris Cl/SDS，pH8.8，

在300毫升H2O中，溶解91克三碱(1.5毫升/升)，用1毫升/升调节酸碱度至8.8，加入H2O至500毫升。溶液用0.45μm滤膜过滤，然后加入2g SDS[0.4%(w/v)]，可在4℃保存1个月。

3)4×三氯/十二烷基硫酸钠，pH6.8，

在40毫升H2O中，溶解6.05克Tris碱(0.5毫升/升)，用1毫升/升调节酸碱度至6.8，加入H2O至100毫升。溶液用0.45μm滤膜过滤，然后加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，可在4℃下保存一个月。

4)4×SDS电泳缓冲液

Tris碱24.2克、甘油115.3克、20%SDS 20毫升

加水至总体积1000ml。

稀释4倍后得到1×SDS电泳缓冲液(tris 0.05m，甘油0.38m，SDS 0.1%)。

5)TEMED (N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基，加速丙烯酰胺和N，N’-亚甲基丙烯酰胺的聚合。

6)10%过硫酸铵

过硫酸铵提供必要自由基来驱动丙烯酰胺和亚甲基丙烯酰胺的聚合。用去离子水可配制少量10%(w/v)的贮存溶液，贮存于4℃。过硫酸铵会慢慢分解，每隔一周要新鲜配制。

实验步骤:

转染后，收集样品，以12000转/分钟离心2分钟，并除去上清液。细胞片段直接进行以下步骤:

3.胶片转移:

转印膜夹心的结构顺序:黑板，网垫，一层滤纸，凝胶(右边用马克笔)，NC膜(膜蛋白质表面左上角的马克笔)，两层滤纸，网垫，白板。

注:所用滤纸也分为粗糙面和精细面，精细面面向凝胶和NC膜，粗糙面面向网垫。当夹层夹放入电极时，黑色板对应黑色面(负极)，白色板对应红色面(正极)。

强调凝胶和NC膜(硝酸纤维素膜)的顺序绝对不能颠倒。使用的NC膜分为粗糙面和有光泽面，粗糙面为蛋白质接受面，与凝胶直接接触。盖槽盖时，注意黑对应黑，红对应红；同样，线电极接电源时，也是黑转黑，红转红。逆转以上任何一个步骤都会导致蛋白膜转移失败，切记。

用于膜转移的参数:稳定流动45mA，过夜(999分钟)。

4.关闭的

使用密封液:5%脱脂牛奶，用TBST配制，室温，30分钟~ 1小时(时间根据实际情况确定，如密封液使用次数、ECL显色背景等)。为了防止奶粉变质，添加了叠氮化钠(光谱防腐剂)，最终浓度为0.02%(本实验室叠氮化钠储存溶液的浓度为2%)

洗:TBST，洗掉残留的奶粉。

5.初级抗体孵育

使用的抗体是小鼠，抗旗帜。

一级抗体稀释度:4%BSA超Block，1:1000。还加入0.02%叠氮化钠NaN3。

孵育:RT，3h左右。

华盛顿:TBST，3 x分钟

6.二级抗体孵育

所用抗体:辣根过氧化物酶，抗小鼠。

二级抗体稀释:5%脱脂牛奶，TBST，1:2000。(二抗一般两三次后更新)(应激:NaN3不能加入到二抗中，因为它能抑制HRP活性)

孵育:RT，1h。

华盛顿:TBST，6 x分钟。

7.色彩发展:ECL。

将300μl溶液A/溶液B等体积混合，现在准备好。用荧光笔在数控胶片上标记标记和样品装载孔的位置。将反应液均匀涂抹在膜上(蛋白侧)，将整个膜浸湿，然后将膜的蛋白侧轻轻向下放入比色计中，盖上盖子，点击开始。

需要注意的事项

1.要胶合的木板必须夹紧，以防漏胶。

2.要装载的板也必须夹紧，以防止泄漏和液体缓慢流动。跑胶速度不一样。原因是两种胶的板材在装车前没有拧紧漏缓液，胶的浓度不同。

3.装载样品时，将标记物5微升和5倍装载缓冲液混合均匀以装载样品，以防止标记物在电泳过程中被样品挤压得越来越窄。

4.转移膜时，用记号笔在NC膜正面左上角做标记，防止在抗体孵育和显色过程中NC膜正面和背面无法区分。

5.转膜前，将NC膜浸泡在转膜液中，注意从一端慢慢往下浸泡。否则，NC膜容易浸湿，影响膜转移。

6.在进行彩色显影时，要从一个侧面慢慢将转印膜液加入到NC胶片中，否则最终的彩色显影效果不好。

7.薄膜转移过程中，NC薄膜与胶水接触前必须没有气泡，否则会对结果的目标条产生影响。

常见问题

1.这部电影是白色的。这是怎么回事？如果能排除以下问题，大部分会出现在一级抗体和抗原制备中。1)二抗的HRP活性太强，消耗底物；2)ECL底物中的H2O2不稳定且失活；3) ECL基底没有覆盖相应的位置；4)一级抗体选择不当；5)二级抗体失活。2.高后台怎么了？膜浸泡不完全均匀，建议用100%甲醇浸泡膜；膜洗不足会增加洗涤液的体积和洗涤次数；如果电极不平衡或采样位置歪斜，可以调整电极和采样；密封胶用量不足会增加密封胶的浓度，保证密封胶在孵育过程中完全浸入转印膜；瓶盖使用不当，如检测生物素标记蛋白不能用脱脂奶粉密封；密封时间不够，通常在室温37℃下停留1小时以上或4℃过夜；7)抗体的非特异性结合可降低抗体浓度和孵育时间。8)一级抗体稀释度不当，可用于检测抗体滴度。9)一抗孵育温度太高，建议在4℃过夜结合。10)如果抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间。11)化学显色底物太多，建议根据说明书添加合适的显色底物。3)为什么是条状？1)凝胶化不均匀或聚合不良，建议凝胶填充前充分混合溶液。2)部分样品含盐量较高，建议脱盐或调整样品含盐量至一致。3)缓冲液陈旧，成分改变，可以重新配制。4)凝胶下有气泡，电泳前应赶走。5)电泳时温度过高，会降低电流或电压。6)样品含有不溶性颗粒，建议充分搅拌混合。4)蛋白带的位置(。胶浓度不对，不同浓度胶的蛋白带位置可能会有偏差，可以调整浓度。抗体孵育不足。建议增加抗体浓度，延长孵育时间。3)酶失活，建议酶和底物直接混合。如果不显色，说明酶失活。选择有效期内的活性酶联产品。4)目标蛋白中存在翻译后修饰或剪切。建议查阅相关文献确定。5)标本中没有目标蛋白或目标蛋白含量过低。建议设置阳性对照比较结果，增加进样量。5.很多异带怎么了？1)靶蛋白有多个修饰位点，可以呈现多个条带。建议查阅文献或进行生物信息学分析，获取蛋白质序列的修饰位点信息，通过修饰确定蛋白质的实际大小。2)样品处理过程中目标蛋白降解，建议添加蛋白酶抑制剂。在冰上处理样品3)外源蛋白较多，建议处理目标蛋白4)特异性强的抗体不强，5)抗体孵育时间过长，建议减少抗体孵育时间6)二级抗体与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭剂7)存在二聚体或聚合物，建议增加蛋白质变性过程和强度8)底物显色和暴露时间过长。建议缩短显色和曝光时间。6.背景有黑点或不均匀的白点，深色背景有白带。1)抗体与封闭剂反应。HRP含量过高，建议降低酶联二抗浓度。3)辣根过氧化物酶偶联的二抗中有聚集体。建议过滤二级抗体试剂以去除聚集体。4)抗体分布不均匀。7.孵育抗体时建议使用摇床。WB应该在细胞水平上进行。多少细胞提取A:一般5× 10 6就够了。8.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？可能的原因如下:1)蛋白质在细胞内不表达，使用新的细胞；2)抗体不能识别目标蛋白。看说明书，看有没有问题；3)可能是低温运行不维持，样品存放不当，样品放置时间过长；4)细胞内蛋白质被酶降解，可以加入蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性。9.我的目的带弱。怎么强化？1)增加抗原负载量很重要；2)还可以降低一级抗体的稀释率；3)曝光时间也可以延长。10.我做的蛋白质分子量很小(10KD)。我怎样才能做WB？1)可选择孔径为0.22um的PVDF膜或NC膜，缩短膜转移时间，可采用Tricine-SDS-PAGE体系；2)也可以选择PSQ膜来缩短转移时间。你也可以把两张胶片折叠在一起，然后转移。可以遵循其他步骤。11、高分子量蛋白质200KD，做WB需要注意什么？1)制作200kd蛋白的WB时，注意分离凝胶的最佳选择>:7%；剥胶时要小心；2)转移时间需要相应延长；去做分子量参考(不然不知道怎么分析杂乱)；3)膜转移溶液中的甲醇含量可以适当降低，建议使用效率更高的湿式填充膜转移！12.如果装载量超载，应该用什么方法增加装载量？样品可以浓缩，一些小分子蛋白可以根据目标分子量透析。一般超载30%没问题。如果已经超过很多，需要小分子量，可以考虑增加胶水厚度，试试1.5 mm. 13。WB中的抗体可以重复使用吗？一般来说，抗体工作液不建议储存和重复使用，但如果抗体珍贵，可以重复使用2-3次。稀释后，应在2-3天内使用，并储存在4度，以避免反复冻融。14.上下罐的缓冲液有什么要求，怎样才能达到最好的效果？没有特殊要求。但一般情况下，上罐装有新鲜的缓冲液，下罐可以使用一两次。15、免疫组织化学和WB可以用同一种抗体吗？在免疫组织化学中，抗体识别未变性的抗原决定簇(也称为表位)。有些表位是线性的，有些是构象的。线性表位不受蛋白质变性的影响，天然蛋白和水煮蛋白都含有线性表位。构象表位受蛋白质空之间的结构限制，蒸煮后变性会消失。如果所用的抗体识别蛋白质上几个连续的氨基酸，即线性表位，则既可用于免疫组织化学，也可用于WB，而如果抗体识别构象表位，则只能用于免疫组织化学。

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