minion 干货！全面解读MinION纳米孔测序技术及应用

点击上面的“转化医学网”订阅我们！

干货|可靠|实用

纳米孔测序技术是近年来出现的新一代测序技术。目前测序长度可达150kb。这项技术开始于20世纪90年代，经历了三大技术革新:第一，单分子DNA通过纳米孔；第二，纳米孔上的酶控制着测序分子的单核苷酸准确性；第三，单核苷酸的测序精度控制。目前，市场上被广泛接受的纳米孔测序平台是牛津纳米孔技术公司(ONT)的MinION纳米孔测序仪。其特点是单分子测序，测序阅读长度长(150kb以上)，测序速度快，测序数据实时监控，机器携带方便。本文重点介绍了MinION音序器的技术特点和应用领域。

1.MinION测序技术简介

MinION纳米孔测序仪的核心是一个流动池，有2048个纳米孔，分为512组，由专用集成电路控制。测序原理如图1a所示:首先，双分子DNA连接到前导衔接子(蓝色)、发夹衔接子(红色)和拖尾衔接子(棕色)；在测序开始时，前导衔接子将测序分子导入由酶控制的纳米孔中，模板读数(待测序的DNA分子)在前导衔接子之后通过纳米孔。发夹衔接子是DNA双链测序的保证，然后补体阅读(待测序分子的互补链)通过纳米孔，最后尾随衔接子通过。上述测序方法中，模板读取和互补读取依次通过纳米孔，两两比对合并成2dread在另一种测序方法中，不使用发夹接头，仅测序模板读数，最终形成1D读数。后一种测序方法具有较高的通量，但测序精度低于2D读数。每个衔接子通过纳米孔引起的电流变化是不同的(图1c)，这种差异可用于碱基识别。

第二，MinION与其他NGS测序平台相比的优势

1.碱基修饰的检测

纳米孔测序技术可以检测4种胞嘧啶碱基修饰，分别是5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。检测准确率为92%-98%。

2.实时序列监控

对于临床实践来说，实时获取和分析DNA/RNA序列是非常重要的。对于传统的NGS测序，很难做到这一点。但是对于MinION来说，相对容易实现。这不仅是因为MinION体积小，容易操作，还因为测序过程中单个分子通过纳米孔，可以检测和识别其当前的变化。这种设计允许用户在排序过程中根据实时结果做出一些判断。实时测序监测对于MinION测序特定的靶序列有重要的应用(图2):当DNA片段通过纳米孔时，如果当前的变化趋势与靶序列相同，它们就会通过纳米孔。如果DNA片段和靶序列表现出不同的电流趋势，就不能通过纳米孔。这样可以实现靶序列的富集，从而显著减少测序时间，对于现场和即时诊断治疗具有重要意义。

3.测量更长的读数

使用MinION序列发生器，可以获得300kb长的1D读取。对于2D读数，可以获得60kb的读数。利用MinION测序仪产生的长读数，研究人员成功填补了人类参考基因组Xq24染色体上50kb的空白。该区域有多个CT47基因的串联拷贝，研究人员用MinION的长读判断该区域有8个CT47基因拷贝(图3)。

4.结构变异检测

NGS短序列的特征常常使结构变异的检测不准确。这个问题在癌症检测中尤其严重，因为癌症组织中存在各种结构变异。研究人员发现，使用MinION测量的数百个拷贝的长读数获得的结构变化结果比NGS平台测量的数百万个读数获得的结果更可靠。

5.核糖核酸表达分析

对于RNA表达分析，NGS平台测得的短序列带来的问题是需要对序列进行拼接才能获得转录本。这给变剪切的研究带来了麻烦。一般来说，NGS测序不能产生足够的信息来区分不同形式的可变剪切。MinION定序器产生的长读可以更好的解决这个问题。研究人员以果蝇的Dscam1基因为例，该基因有18612种可变剪切形式，MinION测序仪可以检测到7000多种可变剪切形式，但这种结果不能通过NGS短序列测序获得。

6.生物信息学支持软件的开发

近年来，随着生物信息学分析方法的发展，MinION测序读数与参考基因组相比成功的比例从66%增加到92%。下面分别介绍各种工具的适用场景。工具概述见表1。

(1)基础识别工具

Metrichor是ONT公司推出的基于隐马尔可夫模型的基础识别软件。它的使用需要网络连接。MinION注册用户需要获得开发者账号才能获得软件的源代码。2016年初，两个实验室分别开发了Nanocall和DeepNano软件。这两个软件都可以在本地运行，不需要网络连接。纳米球是基于隐马尔可夫模型的，它可以在局部识别1D基底。DeepNano是基于递归神经网络框架，比隐马尔可夫模型能获得更准确的基础识别。

(2)序列比对工具

传统的NGS序列比对软件不能满足MinION序列比对的需要。这是因为MinION测序数据的错误率比较高，序列较长，所以即使调整参数，也不能取得好的结果。在这种情况下，适合MinION测序数据的比对软件应运而生。

边际化是通过更好地估计MinION测序读取测序的误差源来提高与参考基因组的比较效率。通过评估检测到的变化，发现它显著提高了对准的精度。由于边际设计是基于最后一个或BWA记忆的比较结果进行优化的，结果的最终准确性取决于初始比较结果。

GraphMap是另一个比较MinION测序数据的软件。它使用启发式方法来优化高错误率读取和长读取。一项研究表明，GraphMap比对的灵敏度与BLAST相当，其对读取序列错误率的估计相当于边际比对。

(3)从头组装工具

MinION测序数据不适合用NGS数据组装的de Bruijn图方法组装，主要有两个原因。第一，de Bruijn图等方法依靠测序读来精确拆分k-mer测序，但高错误率的MinION测序读不能保证这一点；其次，de Bruijn图的结构不适合长读。

MinION测序数据的长时间读取更适合基于重叠共有序列组装的Sanger测序周期。需要的是在组装前对顺序读取进行纠错。第一个基于这一原理的研究小组利用MinION数据组装了一个完整的大肠杆菌K-12 MG1655基因组，序列准确率达到99.5%。他们使用的过程被称为纳米修正。首先，使用基于图的贪婪偏序对齐器方法来纠正错误，然后使用Celera汇编器来汇编已纠正的读数，最后使用纳米抛光来进一步改善汇编结果。

(4)单核苷酸变异检测工具

参考等位基因偏差是一种倾向于在变异检测中检测较少变异的现象。当测序读取的错误率很高时，这种现象尤其严重。

旁注中的MarginCaller模块是一个由研究机构开发的适用于MinION测序数据的变异检测软件。MarginCaller使用最大似然参数估计和多重测序读取序列比对来检测单核苷酸变异。

当计算机模拟测序误差为1%时，测序深度为60倍，由marginCaller检测的SNV具有97%的准确性和完整性。在另一项研究中，研究人员使用GraphMap方法检测人类基因组的杂合变异，准确率可达96%。利用计算机模拟数据，GraphMap还可以以高精度和完整性检测结构变化。

纳米抛光也可以用来检测突变。它使用事件级对齐算法。在该方法中，从参考基因组序列开始，依次评估参考基因组序列产生的电信号和测序读数之间的相似性，然后依次修改参考基因组序列以产生共有读数。直到共有读取和测序读取产生的电信号足够相似，将共有读取与参考基因组序列进行比较以获得变异。该方法在埃博拉病毒研究中的准确率约为80%。

PoreSeq使用了类似于Nanopolish的算法。它可以使用较低深度的测序数据获得高精度和完整性的SNV检测。在一项研究中，PoreSeq在16X测序深度实现了99%的SNV检测准确性和完整性，这与旁注相比显著降低了测序深度。

(5)一致测序法

MinION测序数据的准确率目前只有92%。在低深度测序条件下，不能满足SNV检测相似单倍型和人类样本的要求。解决这一问题的方法是滚圆放大法。其原理是在一个DNA分子上多次扩增一个片段，产生多个拷贝，这样最终共有序列测序结果的准确率可达97%。

第三，MinION目前的应用领域

1.立即发现传染源

NGS测序法可用于检测医院环境中的传染源等病原体，而MinION测序法提供了全新的体验。MinION在测序长度、可移植性和检测时间上具有NGS无法比拟的优势。文献记载，从样品制备到病原体发现只需6小时，从样品放置到病原体发现只需4分钟。本文列举了迄今为止用MinION测序仪进行研究涉及的物种，详细描述了在西非爆发埃博拉病毒时，MinION测序法在病毒检测中的重要作用。

2.非整倍体检测

MinION在胎儿非整倍体的产前检测中可以发挥重要作用。使用NGS平台，通常需要1-3周才能得到结果。而使用MinION测序法，文献报道仅需4小时。

3.Tai 空的应用

在Tai 空的飞行过程中很难发现细菌和病毒。大多数研究是将样本带回地球进行测序和鉴定。目前NASA准备使用MinION测序仪在国际空站进行病原体实时测序。

四.前景

1.PromethION

为了满足研究人员对高通量测序的需求，ONT开发了一种台式纳米孔测序仪——PromeXiom。PromethION有48个流动池，可以独立运行或并行运行。每个流动池包括3000个通道，每天产生6Tb测序数据。

2.序列读取精度

目前MinION测序仪的测序准确率在92%左右。对于相似的病原菌和可变剪切挖掘，这样的测序精度可以满足需求。然而，对于临床测试来说，读数的准确率通常需要达到99.99%。因此，提到ONT需要优化与测序相关的化学反应和碱基识别软件。

此外，还提到了MinION测序法存在非随机测序误差。比如MinION不能处理6个核苷酸以上的均聚物测序，缺乏碱基修饰检测的内部参考训练。如果能解决这两个问题，共识测序的准确率可以达到99.99%以上。

3.读取长度排序

目前MinION的测序长度达到150kb。未来可以预期其测序长度会有很大的提高。

4.核糖核酸直接测序

逆转录和聚合酶链反应扩增会导致大量核糖核酸信息的丢失，因此ONT和一些研究机构正试图利用纳米孔技术进行核糖核酸直接测序。前人的研究为此奠定了基础。比如研究表明单通道和固态纳米孔可以用来检测tRNA，纳米孔可以检测DNA和tRNA的碱基修饰。

5.单分子蛋白质测序

目前，质谱是一种很好的蛋白质组分析技术，但在灵敏度、准确性和分辨率方面存在局限性。2013年，一项研究报告称，酶介导的蛋白质通过单通道纳米孔。这项研究表明，可以检测蛋白质的序列特征。这些发现为蛋白质纳米孔测序奠定了良好的基础。

参考文献:

牛津纳米孔迷你机器人:向基因组学社区交付纳米孔测序

结束

点击图片了解更多关于提交的信息！