多聚甲醛固定 多聚甲醛固定，没那么简单

多聚甲醛固定真的是老生常谈了。很多研究生做实验的时候，很多师兄师姐可能会让他们用多聚甲醛固定。他们中的一些人可能想专注于染色，以便长时间保存样品，一些人可能想在染色后长时间保持质量稳定。所以是口耳相传的。

预先解决的问题

在做科研或临床工作时，很多FLOWER习惯性地用4%多聚甲醛预固定标本，可能有三个目的:灭活微生物。)可能存在于标本中，从而确保安全。希望标本能长期保存。细胞内染色前的准备。但很多人可能忽略了一点，就是如果标本在染色前用多聚甲醛固定，固定后细胞表面某些位点的构象发生改变，使抗体无法结合而产生假阴性，或者因为固定，其他位点产生非特异性结合。

因此，在染色前知道哪些抗体不能预固定是非常重要的。幸运的是，我们不必自己做验证。在Biolegend公司的网站上，贴心的技术人员已经为我们做了一系列的测试。下面两个表，一个是人抗原，一个是小鼠抗原，可以看出大部分不能预固定的抗体都是趋化因子受体。所以在实验中一定要注意不要先固定再染色。

表1 .4%多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响。检查时允许预固定，交叉时预固定影响较大。

表2 .4%多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响。检查时允许预固定，交叉时预固定影响较大。

染色后固定问题

染色后固定与抗原构象关系不大，与荧光素关系更大。以前用的荧光素不是串联的，所以大部分作用不大。然而，随着各种新型串联染料的出现，多聚甲醛的固定成为一个问题。

其实当你搜索带有串联染色标记的抗体时，你会发现一些详细的描述会说明:

固定细胞应在多聚甲醛中固定后4小时内进行分析，或转移到无多聚甲醛的缓冲液中过夜储存。

这意味着用多聚甲醛固定的样品必须在4小时内检测到，否则很容易导致串联染料的降解。如果需要长期保存，需要清洗后转移到不含多聚甲醛的缓冲溶液中。

需要注意的是，做GFP荧光检测的同学也要注意，多聚甲醛固定也会影响GFP。纽约医学院的Paul A Lucas认为，多聚甲醛固定后，GFP荧光没有淬灭，而是GFP蛋白的构象发生了改变，不能产生荧光。有时在固定后检测到的荧光可能是自发荧光，或者是未改变构象的其余绿色荧光蛋白。

解决办法

1.如果上表中检测到的分子容易受到多聚甲醛的影响，请尽量不要预固定。如果需要长期保存样本，可以考虑冷冻保存单核细胞。

2.如果被检测分子不受上表中多聚甲醛的影响，可以用1%多聚甲醛预固定保存，但不能长期使用，否则会对细胞的FSC、SSC和荧光强度产生很大影响。此时可以考虑使用Flow中文网的FlowGuard细胞保存液。FlowGuard是国内专利原创研究产品，不含多聚甲醛，能缓慢释放一种特殊的弱固定成分。FSC比多聚甲醛变化更轻微，多聚甲醛可以更长时间保持抗原强度。样品:保存液= 6: 1 ~ 10: 1，21天内检测结果稳定。

3.如果想在染色后24小时左右保持荧光稳定，还是第一个建议:避光，4度。我们在10色流程方案的非正式测试中测试了几个案例。如果还是不放心，可以考虑购买适合串联染料的商业专用防腐剂。

参考

biolegend公司网站:https://www.biolegend.com/fixation

纽约医学院的Paul A Lucas认为，固定的多聚甲醛并不淬灭GFP的荧光，而是改变GFP蛋白的构象，使其不能产生荧光:https://www.researchgate.net/post/GFP _荧光_后_固定10

FlowGuard中文网细胞保存液:https://kdt.im/PhQvsr