聚合酶链式反应 聚合酶链式反应基本操作步骤

〔PCR步骤〕标准的PCR过程分为三步:1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA2.退火(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链.

3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链.

每一循环经过变性/退火和延伸,DNA含量既增加一倍.

现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.

〔PCR检测〕PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键.

荧光素(溴乙锭)染色凝胶电泳是最最常用的检测手段.

电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判.

但因为其简捷易行,成为了主流检测方法.

近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势.

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,PCR)三步:1 变性:模板DNA加热变性2 退火 引物与它的靶序列发生退火,引物DNA量多,使引物和模板在局部形成杂交链3 延伸 4种dNTP 与 Mg2+ 存在的条件下,DNA合成酶催化以引物为起始点,按5"-3"方向进行延伸.

上面三步为一个循环,可使拷贝数到达2*Ｅ－6-2*Ｅ－7PCR 产物一段双链DNA,是由它的末端引物的5"端决定的.

PS:1.首轮扩增,其产物是大小不均一的DNA分子.

长度应大于两引物之间的长度.

在第二个循环中,由于5"固定,其产物长度就由等于两引物之间的长度.

所以几十个循环后就会产生大量的两引物之间序列.

引物设计:1,长度15~30个核苷酸,最多到50个核苷酸左右.

2, 尽量避免嘌呤和嘧啶堆积的现象.

(其实有时很难避免,不是很重要).

3,引物内部不应该形成二级结构,如果引物中有酶切位点时,就会出现引物二聚体.

(一般不是很重要)PCR的反应条件１,dＮＴＰ浓度过高会加快反映速度,但同时还可以增加碱基的错误掺入率.

２, 引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增.

３,ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增,低则合成产物量减少.

ＴａｑＤＮＡ聚合酶无校正功能,掺入错误率达2*E-4个核苷酸,一个３０个循环的扩增反应0.1％-0.25％总错误率.

４, 在９０～９５度下可使整个基因组的ＤＮＡ变性为单链.

一般９４～９５度３０～６０s.

时间过长使ＴａｑＤＮＡ聚合酶失活和dＮＴＰ破坏增多.

５,ＤＮＡ很快冷却到４０～６０度使引物和模板结合.

引物长度在１５～２５时退火温度Ｔｍ＝４(Ｇ＋ｃ)＋(Ａ＋Ｔ),一般在４５～５５度,温度低容易退火但特异性低;温度高,不容易退火但特异性高.

退火时间３０秒.

６,延伸温度一般在７０～７５度这是ＴａｑＤＮＡ聚合酶活性最高(１５０个／Ｓ),当引物在１６个碱基以下时可采用缓慢升高温度到７０～７５度的方法,使在低温下就开始合成.

一般<１ＫＢ时间１分钟即可.

当〈１ＫＢ时在较后的循环中延长扩增时间.

７循环次数２５～３０次.

无产物时:１,取１０ul扩增混合液作模板在进行ＰＣＲ扩增.

２,增加ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度３,增加循环次数４,降低退火温度５,加靶ＤＮＡ量.