通用引物测序想要完美，引物的选择很重要

路遥说，人生的路虽然漫长，但在关键时刻往往只有几步，尤其是人年轻的时候。同样，科研之路虽然漫长，但决定成绩的只有几点，尤其是做实验的时候是否细心。

影响桑格测序结果的条件很多。详细描述了稳定单带聚合酶链反应产物的制备。今天，我们将分析另一个关键因素——如何选择测序引物。

测序引物不能等于PCR扩增引物，需要满足以下条件:

对比|通用引物优势明显

测序的通用引物一般根据元件(启动子、终止子等)来选择。)的载体，例如常见的通用引物T7是T7启动子，CMV-Forward是由CMV启动子设计的，M13F来源于lac Z基因。现在常用的引物还包括为一些载体设计的载体引物，如根据载体的绿色荧光蛋白基因设计的pEGFP-C-3。

测序公司通常会免费提供一些常用引物。这些经QC验证的引物质量保证较好。用载体的通用引物测序可以监测目标片段是否成功克隆到载体中(是否为/[/k0/)。考虑到通用引物的技术和成本优势，金建议你在实验中尽量选择通用测序引物。

一般在PCR产物(尤其是短PCR产物)测序结果不理想时，可以将PCR产物克隆到载体中，用载体的通用引物进行测序。特别是当PCR片段长度小于200bp时，建议你优先克隆到载体中测序。

配对|载体和位点是关键

通用引物只与载体相关，不受靶片段的限制。测序时，应针对不同载体选择不同的通用引物。

对于某个载体应该选择哪些通用引物，可以通过金伟志公司官网“服务资源”中的“免费通用引物”或者金伟志在线订购系统中的“通用引物选择工具”进行查询。

几种常见载体使用的通用引物

除载体外，引物结合位点对通用引物的选择也有很大影响。由于Sanger测序法的限制，最初的50bp-100bp测序通常不稳定，一般引物不要离克隆位点太近(建议大于50bp)，否则可能检测不到一些靶片段。因此，T载体(pMD 18-T载体)的测序通常选择正向引物M13F(-47)和反向引物M13R(-48)，但不推荐使用M13F和M13R。