ppic9k 刘嘉男┃α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵及其固定化

α-L-鼠李糖苷酶的高密度发酵及固定化

刘佳楠、龚建业、高庭、李丽君*、倪慧

摘要:在5 L发酵罐中发酵α-L-鼠李糖苷酶制备酶液。以聚乙烯醇-海藻酸钠为包埋载体，戊二醛为交联剂，固定化酶。经5 L发酵罐高密度发酵96 h后，α-L-鼠李糖苷酶活性为2 766 U/g，生物量为228 g/L..固定化后，α-L-鼠李糖苷酶的酶活为20 U/g，酶活回收率为32.88%。固定化α-L-鼠李糖苷酶的最适反应温度为35 ~ 50℃，最适反应pH值为4.0。固定化α-L-鼠李糖苷酶连续使用6次，酶活仍保持在98.22%。高密度发酵可以显著提高酶的产量，固定化技术可以提高酶的重复利用率，为酶法转化芦丁制备异槲皮苷提供了基础。

α-左旋鼠李糖苷酶；高密度发酵；酶的固定化；异槲皮苷

异槲皮苷是一种含有多个酚羟基的黄酮醇苷类化合物，具有消炎、抗氧化、降血糖、降血压、抗过敏等药理作用。异槲皮苷的天然含量很少，所以常通过水解芦丁来制备。常用的方法有芦丁的强酸水解、有机溶剂提取、芦丁的高压水解和芦丁的酶水解等。.其中强酸和有机溶剂萃取法严重污染环境，高压水解法要求耐高温高压，消耗大量能源。然而，酶法水解芦丁操作过程相对简单，反应条件温和，污染少，具有重要的研究和应用价值。

α-L-鼠李糖苷酶可用于水解芦丁上的1，6-α-鼠李糖苷键制备异槲皮苷。吴迪重组毕赤酵母GS115/pPIC9k-rha菌株由集美大学发酵工程实验室保藏。芦丁购自Xi小草植物科技有限公司；甲醇、乙腈购自sigma aldrich有限公司；其他试剂是分析纯的。等人的研究表明，利用芦丁-L-鼠李糖苷酶将芦丁转化为异槲皮苷是制备异槲皮苷的理想方法，且条件温和，易于控制。因此，研究相关酶的发酵生产具有重要意义。张1.2仪器和设备等对黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶的高密度发酵条件进行了研究，取得了一定的成果。而黑曲霉产生的其他许多蛋白质，发酵后需要通过纯化去除，固态发酵产生菌丝体，给纯化带来不便BLBIO-5SJ发酵罐，上海百伦生物科技有限公司；DGU/SPD/SIL-20A高效液相色谱仪，日本岛津仪器制造有限公司；上海博讯医用生物仪器有限公司ALP自动灭菌锅；海门麒麟贝尔仪器有限公司ZD-9550脱色摇床。巴斯德毕赤酵母表达系统具有表达效率高、自分泌蛋白少的特点，易于纯化胞外表达的目的蛋白将1毫升重组毕赤酵母GS115/pPIC9k-rha菌株接种到由3.325克无氨基酵母氮源、3.725毫升甘油、0.1毫克生物素和250毫升无菌水制备的种子培养基中，然后在30℃摇床中以200转/分钟的速度培养直至出现白色晶体，然后接种到2.5升接种量为5%的发酵培养基中，体积分数为25%；此外，毕赤酵母成熟的发酵工艺适合高密度发酵，能够满足α-L-鼠李糖苷酶的工业化应用。发酵过程中甲醇添加量的研究是保证毕赤酵母不会被甲醇毒害，保持外源蛋白正常分泌的重要因素培养基中的甘油耗尽后，初始流动加速率为10毫升/。10小时后，流速增加至500毫升/，酵母培养至所需密度。发酵过程中每8小时取样一次，以测量湿重和酶活性。。固定化α-L-鼠李糖苷酶可以简化反应体系中酶的分离过程，提高酶的稳定性和重复利用率，节约成本，简化催化过程，提高生产效率甘油补料分批培养至所需密度后，停止补料甘油，调节溶解氧至60%左右并维持30 min，然后调节发酵温度至28℃，调节pH值至pH 5.0，继续发酵，开始补料甲醇。甲醇的流量加速前2 h为3ml/，后每1 h增加1ml/，当流量为6ml/时，维持3 ~ 4h。此后，每隔1小时向甲醇中添加0.17%、0.5%和1%的2.5 L体积分数的发酵液，并且每隔8小时取样以测量酶活性。甲醇诱导3天后，获得发酵酶溶液。。因此，通过优化甲醇用量，提高了α-L-鼠李糖苷酶的高密度发酵产量，并对α-L-鼠李糖苷酶的固定化特性进行了研究，为α-L-鼠李糖苷酶的工业化生产和芦丁酶法转化为异槲皮苷提供了依据。

1.1材料和试剂

1.3实验方法

1.3.1 α-L-鼠李糖苷酶在5 L发酵罐中发酵培养

1.3.2生物量和酶活性的测量

将1毫升发酵液放入1.5毫升离心管中，以8 000转/分钟的速度离心2分钟，倒出上清液，洗涤并干燥，称重，得到细菌的干重。

酶活测定采用高效液相色谱法 :将质量浓度为300 μg/mL的1.0 mL芦丁标准溶液加入到10 mL离心管中，然后加入980 μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，涡旋混合均匀，置于60℃水浴中保温10 min，快速加入20 μL酶液，混合均匀。在60℃恒温水浴中反应15分钟后，立即在沸水中灭活12分钟，然后冷却并通过0.22微米滤膜过滤。空白色对照组用灭活酶液代替原来的酶液，其余步骤同上。用高效液相色谱法测定芦丁含量，并计算酶活性。采用对称C18反相柱，柱温35℃，紫外检测波长280 nm，进样量20 μL，流速0.25 mL/min，采样时间60 min，流动相为A: 0.5%甲酸水溶液，B:乙腈。优化的梯度洗脱条件如表1所示。

表1液相洗脱条件

表1液相洗脱条件

α-L-鼠李糖苷酶活性单位的定义:每分钟消耗1 μmol芦丁所需的酶量定义为一个α-L-鼠李糖苷酶活性单位。

1.4固定化酶凝胶颗粒的制备

称取0.1 g海藻酸钠和2.4 g聚乙烯醇，加入34 mL无菌水加热溶解；冷却后，加入0.5毫升戊二醛静置1小时；将6毫升质量浓度为9.3毫克/毫升的酶溶液滴入交联溶液中，在恒温振动器中振动；2小时后，加入1.6克硼酸和0.4克氯化钙进行搅拌和造粒。15分钟后，放入10% Na2SO4中4 h，得到固定化酶凝胶颗粒，并在pH 4.0乙酸缓冲液中于4℃保存。

1.5固定化α- L-鼠李糖苷酶性质的测定

1.5.1固定化α-L-鼠李糖苷酶酶活性的测定

酶活性测定反应体系:将0.98毫升柠檬酸缓冲液和1毫升质量浓度为300微克/毫升的芦丁底物混合，在50℃孵育10分钟，然后加入1克固定化酶溶液并混合均匀，在50℃反应15分钟后，立即取出固定化酶，将体系置于100℃沸水浴中10分钟并冷却空用白色反应代替加入的酶溶液

1.5.2固定化α-L-鼠李糖苷酶最适温度的确定

最适温度:将固定化酶按比例加入pH值为4的柠檬酸缓冲液中，混合均匀，分别在酶反应体系中于30、35、40、45、50、55、60℃反应15分钟，测定α-L-鼠李糖苷酶的活性，最高活性为100%，空白色基团如下

1.5.3固定化α-L-鼠李糖苷酶最适酸碱度的测定

最适pH:将固定化酶按一定比例加入不同pH 的50 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中，在50℃测定α-L-鼠李糖苷酶的活性，最高活性为100%，在相同条件下，空白色组在100℃灭活酶反应。

1.5.4固定化α-L-鼠李糖苷酶的底物动力学

以不同浓度的芦丁为底物，在最适pH和温度下测定α-L-鼠李糖苷酶的活性，并根据Linewaver-Burk图双倒数曲线作图法计算重组酶对柚皮苷的米氏常数

1.5.5固定化α-L-鼠李糖苷酶的操作半衰期和稳定性

将固定化酶置于pH4的柠檬酸盐缓冲液中，在50℃下温浴，每1小时取适量固定化酶，根据酶活性反应体系测定酶活性。初始酶活为100%，计算相对酶活。

取适量固定化颗粒，根据酶活性反应体系在最适pH和温度下连续进行6批操作，计算出相对酶活性，最高酶活性为100%。

2结果与讨论2.1α-l-鼠李糖苷酶的发酵结果

α-L-鼠李糖苷酶的发酵结果如图1所示。在5 L发酵罐中，当发酵罐中溶解氧增加，甲醇体积分数分别为0.17%、0.5%和1%时，重组毕赤酵母GS115/pPIC9k-rha的酶活性和生物量随着诱导时间的增加而增加，诱导发酵结束时的酶活性分别为1 865.8、2 766.0和1 979.9 u/L。甲醇不仅是毕赤酵母细胞生长所需的碳源，也是细菌在发酵过程中的能量物质。如果甲醇的量太少，细菌将没有足够的能量分泌外源蛋白，因此酶活性会降低。如果甲醇的量过高，会产生毒性作用，抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，也会影响酶活性的结果。因此，发酵过程中甲醇的最佳用量为发酵液总体积的0.5%。与摇瓶发酵的最佳条件相比，发酵罐发酵后的酶活性是摇瓶发酵的3.89倍。

不同甲醇添加量对酶活性的影响；不同甲醇添加量对生物量的影响

图1不同甲醇添加量下的酶活性和生物量结果

图1不同甲醇添加剂的酶活性和生物量结果

SDS-PAGE用于鉴定重组α-L-鼠李糖苷酶，结果如图2所示。在泳道中可以看到分子量约为100 kDa的单一条带，其大小类似于来自黑曲霉的原始α-L-鼠李糖苷酶。总的来说，发酵上清液中目的蛋白纯度高，外源蛋白含量低，可以直接固定化发酵上清液。

图2重组α-L-鼠李糖苷酶的SDS-PAGE

图2重组α-L-鼠李糖苷酶的SDS-PAGE

2.2固定化酶的制备

海藻酸钠聚乙烯醇用于制备固定化酶凝胶颗粒时，聚乙烯醇有利于增强凝胶的耐久性和机械强度，海藻酸钠可以形成粘稠且均匀的溶液，可以改善凝胶的表面性质，降低聚集的可能性。最终产品如图3所示。固定化α-L-鼠李糖苷酶珠粒大小均匀，弹性好，圆形光滑，具有一定的机械强度，酶活为20 U/g，酶活回收率为32.88%。

图3制备的固定化α-L-鼠李糖苷酶

图3固定化α-左旋鼠李糖苷酶的图片

2.3固定化α- L-鼠李糖苷酶酶学性质的研究

2.3.1固定化酶的最佳温度

在30 ~ 60℃和pH 4.0条件下测定了酶活性，并确定了固定化α-L-鼠李糖苷酶的最适温度。从图4可以看出，随着温度的升高，固定化α-L-鼠李糖苷酶的活性先升高后降低。固定化酶的最适温度为50℃。前期实验表明，游离酶的最适温度为60℃。由于固定化载体聚乙烯醇和海藻酸钠的熔点较低，温度高于50℃后，固定化酶的胶体开始熔化，由于这个因素，用这种方法制备的固定化酶耐热性较差。而固定化α-L-鼠李糖苷酶在35 ~ 50℃时仍保持较高的催化活性，与游离酶相似。

图4温度对固定化α-L-鼠李糖苷酶活性的影响

图4不同温度对固定化α-L-鼠李糖苷酶剩余活性的影响

2.3.2固定化酶的最适酸碱度

固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活测定在50℃和酶反应体系的酸碱度分别为2，3，4，5和6。当pH为2时，海藻酸钠降解明显，不能形成凝胶颗粒，因此固定化酶的初始pH值为3。固定化酶的最佳酸碱度结果如图5所示。固定化α-L-鼠李糖苷酶的最适pH范围为3.0 ~ 4.0，与游离酶相同。随着酸碱度的增加，酶活性迅速下降，表明固定化酶在酸性环境下具有较好的催化性能。

图5不同酸碱度对固定化α-L-鼠李糖苷酶活性的影响

图5不同酸碱度对固定化α-L-鼠李糖苷酶残留活性的影响

2.3.3动力学参数的测定和分析

在60℃，pH 4.0的条件下，以不同浓度的芦丁为底物，测定了固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活力，并计算了其初始反应速率。以1/为横坐标，1/为纵坐标，绘制了lineweaver-Burke双倒数拟合曲线。动力学结果如图6所示，lineweaver-Burke双倒数的拟合方程为y =固定化酶水解反应的米氏常数Km计算为0.47 mmol/L，而在以前的实验中发现游离酶的Km为0.25 mmol/L，固定化酶的Km值大于游离酶的Km值。NUNES等人研究发现，固定化酶的Km值也大于游离酶，这说明固定化底物后，空在树脂载体中的空间位阻和扩散效应导致酶与底物的亲和力降低，初始反应速率增加。

图6固定化α-L-鼠李糖苷酶的Linewaver-Burk图

图6固定化α-L-鼠李糖苷酶的Linewaver-Burk图

2.3.4半衰期和运行稳定性

重组α-L-鼠李糖苷酶的半衰期如图7所示。在6 h时，酶活性下降到初始酶活性的50%。随着操作次数的增加，反应体系中固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活发生变化，如图7所示。

α-固定化α-L-鼠李糖苷酶的半衰期；固定化α-L-鼠李糖苷酶的操作稳定性

图7固定化α-L-鼠李糖苷酶的半衰期和操作稳定性

图7固定化α-L-鼠李糖苷酶的半衰期和操作稳定性

固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活性随着反应次数的增加而逐渐增加。出现这种情况的原因可能是最初的聚乙烯醇-海藻酸钠载体强度强但传质性能差，产生了一定的空间位基团和屏蔽效应，从而影响了酶的活性。然后，随着反应次数的增加，载体强度减弱，包埋酶逐渐与底物接触，芦丁转化强度增加。连续使用6次后，凝胶颗粒基本处于透明胶化状态，但相对酶活仍保持在98.22%。结果表明，固定化α-L-鼠李糖苷酶具有良好的操作稳定性，有利于重复使用，具有工业化大生产的潜力。

3结论

本文对重组黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶在5 L发酵罐中进行了高密度发酵和酶固定化实验，并测定了固定化α-L-鼠李糖苷酶的性质。发现当甲醇体积分数为0.5%时，酶活最高，为2 766单位/毫升。以1%海藻酸钠和10%戊二醛为交联剂，制备了固定化α-L-鼠李糖苷酶。最适温度为40℃，最适酸碱度为4.0。固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活为20 U/g，酶活回收率为32.88%。α-L-鼠李糖苷酶的高密度发酵和固定化为进一步扩大α-L-鼠李糖苷酶发酵工艺和工业化生产异槲皮苷提供了理论依据和指导。

α- L-鼠李糖苷酶的高密度发酵及酶促动员

刘佳楠、龚建烨、高婷、李丽君*、倪慧

摘要以戊二醛为交联剂，将高密度发酵生产的α-L-鼠李糖苷酶固定在聚乙烯醇和海藻酸钠组成的基质中。在5 L生物反应器中，经过96 h培养，固定化酶的活性达到2 766 U/g，生物量达到228 g / L。固定化酶的酶活回收率为32.88%，固定化酶的酶活为20 U/ g，最适温度为35-50 ℃，最适反应pH为4.0左右。经过6批循环使用，剩余酶活可保持在98.22%以上。这些结果表明高密度发酵可以有效提高酶的产量，固定化技术可以提高酶的回收率，为异槲皮苷的大规模生产提供了基础。

关键词α-L-鼠李糖苷酶；高密度发酵；固定化酶；异栎素

DOI:10.13995/j . CNKI . 11-1802/ts . 016143

引用形式:刘佳楠，龚建业，高庭，等.α-L-鼠李糖苷酶的高密度发酵及固定化.食品与发酵工业，2018，44:44-48；54.刘佳楠，龚建业，高婷，等。α-L-鼠李糖苷酶的高密度发酵及酶固定化。食品与发酵工业，2018，44:44-48；54.

第一作者:硕士研究生。

基金项目:国家自然科学基金

收到日期:2017年10月29日，修改日期:2011年1月26日