梯度稀释的目的 浅析ELISA中的常见问题

酶联免疫吸附试验是蛋白质定量的金标准，也是免疫学研究中最常用的实验方法之一。很多人觉得ELISA简单，其实不然。ELISA中的各种问题都是由于很多人对ELISA缺乏了解造成的。今天就来分析一下ELISA实验中常见的问题，希望对大家有所帮助。

第一，标准音乐不显色或颜色很淡，样品显色

当标准物质经多次溶解稀释后，不产生漩涡或不足。标准物质溶解时，需要涡旋振荡，以保证完全溶解。做多次稀释时，还需要涡旋振荡，以保证充分混合。效率低，如果只靠移液管反复吹，效果不一定最好。

第二，标准歌曲和样本不显色

在孵育阶段，不利于抗原和抗体的充分接触，导致显色微弱。在孵育阶段，建议使用专门的微孔板振荡器进行ELISA，并调整到合适的频率，使抗原和抗体充分接触，保证结合效果。

如果排除上述原因，有可能省略了某个成分，如检测抗体、酶等。对于马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用带染料的ELISA试剂盒。

三是标准曲线发达，样品不发达

在这种情况下，很多人认为是套件问题，其实是一种误解。任何实验方法都有其局限性。当样品中目标蛋白浓度极低或样品中干扰因素较强时，则无法检测。目前，酶联免疫吸附法仍然是最敏感的蛋白质检测方法。结合不同的技术，衍生出多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。例如使用信号增强剂的高灵敏度ELISA、使用ECL作为底物的化学发光ELISA、使用荧光检测的ELISA、免疫PCR结合PCR扩增等。

对于目标蛋白浓度极低的样品，我们可以尝试使用高灵敏度的ELISA，但这并不一定意味着可以检测到样品浓度，而是可以提高样品的可测率，使结果更加可靠。由于普通ELISA检测的样品的OD值通常较低，甚至低于标准物质浓度最低的S7点，虽然可以计算出该值，但该值的可靠性实际上已经下降。但高灵敏度的ELISA可以提高样品的OD值，使其尽可能在标准曲线范围内，得到的值更可信。需要指出的是，国内一些所谓的高灵敏度ELISA试剂盒并没有采用信号增强剂的方法，只是简单的增加抗体浓度，与普通ELISA相比灵敏度有限。

还有人觉得，为什么样品值可以用其他厂家的试剂盒来测量，而我们的却不行？这里涉及到回收率的概念，下次再详细讨论。简而言之，回收率是样品的真实值和理论值之间的比率，对于优秀的试剂盒，回收率在80-120%之间。与回收率相关的试剂是试剂盒中标准品的稀释液。选择合适的标准稀释液，使标准品和目标蛋白含量相近的样品显色速度相近，那么计算出的样品值会更接近真实值。样品值的测定并不难，只要选择合适的标准稀释液，降低标准曲线的背景，样品值自然会计算出来。但这样的样本值并不真实，对科学研究的参考意义不大。

第四，标准曲线和样品都显色，但是复杂孔的CV大

这个问题与移液器和实验人员的操作有关。如果移液器的使用和维护不规范，移液的误差会很大。实验者自身的操作习惯和加样的一致性对复杂孔的CV也有很大影响。您可以参考关于移液器使用的文章来正确使用和维护移液器。个人操作可以在空白板上练习移液动作，或者在几十个离心管中加入相同体积的水，用电子天平称量，测试移液的精度。同时，需要练习加快采样速度，减少从第一个样本到最后一个样本的采样时间过长带来的差异。

第五，背景高，样本值无法测量

校准曲线的背景，即空白井的OD值，一般要求控制在0.1以下(对于高灵敏度的ELISA，可以适当放宽要求)。特别是当采样值极低时，高背景会掩盖目标信号，导致采样值无法测量。

加入TMB进行显色后，需要实时观察标准音乐的显色情况。通常S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，可以停止反应。

第六，样本用不同的梯度稀释，计算出的样本值差别很大

有时我们不知道样品中目标蛋白的浓度和如何稀释，所以我们会做一个预实验来确定稀释倍数。然而，有时，在同一样品被几个不同的梯度稀释后，计算的样品值会有很大的不同。应该选择哪个稀释倍数？

这里涉及到矩阵效应。通常血清样品用量大时，血清中的各种蛋白质会抑制抗原与抗体的接触，基质效应明显。稀释后，干扰因素也会被稀释，影响会更小。当两个梯度稀释后计算的样本值接近时，我们可以认为样本中的干扰因素影响很小，计算值接近真实值。然而，这种稀释适用于目标蛋白浓度高的样品。对于浓度非常低的样品，经过多次稀释后，甚至更不可检测。此时可以使用厂家说明书推荐的加样方法。

七、同一样品用不同厂家的ELISA试剂盒检测，计算出的样品值相差很大

这涉及评估试剂盒性能的另一个参数——校准。不同的厂家可能采用不同的标准，其定量方法和标准也不同。这是企业标准。因此，即使在不同厂家不同的实验条件下测定相同的标准，结果也可能相差很大。

因此，我们不建议比较不同制造商的结果，除非它们是用国际标准校准的。但并不是所有的蛋白质都有国际标准，所以不同厂家计算出来的样本值不可避免的有很大差异。

但是，如果所有样品都用同一个制造商的试剂盒检测，结果仍然可以进行统计分析。

八、不同套件中的组件能否通用

除非是常用试剂，如洗涤液、检测缓冲液，否则不建议使用其他试剂盒的成分，即使是同一指标不同批次试剂盒中的成分。这些成分(包括标准品、标准稀释液、检测抗体、酶等。)进行了优化。如果贸然使用其他试剂盒的成分，可能会影响结果。

总结问题

与众多国际知名厂商达成长期合作协议，包括Affymetrix(eBioscience)、PeproTech、QIAGEN、Bio-Techne(RnD、Novus)、罗氏等。联科生物也在开发具有自主知识产权的项目和产品，其中ELISA试剂盒的灵敏度、精密度、准确度等综合性能指标处于行业领先水平。还有流动、Western Blot、分子、细胞培养等独立产品，产品齐全，性能优越，质量可靠。

投稿&请联系shiyanxiaobai@126.com合作及其他事宜；微信号“Cjer0201”。