实时荧光定量聚合酶链反应引物设计
实时荧光定量聚合酶链反应是实验室中最常用的实验。研究基因的mRNA表达水平，验证基因敲除后下游靶基因的变化。
首先，实时荧光定量聚合酶链反应是一种用荧光化学物质在DNA扩增反应中测量每个聚合酶链反应循环后产物总量的方法。通过内部参考或外部参考对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。
最常用的方法是SyBrGreenⅰⅰ和TaqMan探针法。下面介绍原理:
1.
SYBRGreenⅰⅰ方法:
在聚合酶链反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性掺杂到DNA双链中，然后发出荧光信号，而未掺杂到链中的SYBR染料分子不发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与聚合酶链反应产物的增加完全同步。
2.
TaqMan探测方法:
探针完成后，报道基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；在聚合酶链反应扩增过程中，Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性降解探针，并将报告荧光团与淬灭荧光团分离，使得荧光监测系统可以接收荧光信号。所以他每扩增一条DNA链，就形成一个荧光分子，荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步。
在设计实时荧光定量聚合酶链反应引物之前，每个人都应该知道引物设计中应该注意的一些细节和原则。
这里有两个在线设计实时荧光定量PCR引物的网站，不需要安装软件就可以直接在网上完成。
一个
黄金银行.
网站:https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
1.首先，进入网站主页，选择关键词，根据自己的需要选择物种和基因名称。
2.点击提交，出现如下界面。网站会推荐多对引物，可以根据引物长度和Tm值进行选择。
二
Primer3plus .
网站；http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
1.PUBMED获得基因序列后，在primer3plus主页上输入基因序列。
2.单击常规设置设置引物扩增长度。一般可以把扩增长度设置的大一些，然后根据推荐的引物选择合适的扩增长度。
3.点击pick引物后，首先会看到一对首选和推荐的引物，同时会看到引物在序列中的位置。引物的Tm值和GC含量可以在Primer3plus网站上看到。
三
设计引物后，
最好在NCBI BLAST检查一下引物的特异性，然后交给公司合成。
1.进入pubmed主页，点击BLAST中的nuclear BLAST。
2.选择一个引物序列并将其输入对话框，然后单击BLAST。
3.网页打开后，会看到如下界面。不同的颜色代表引物序列的得分，一般会选择40分以上，也就是至少蓝色。继续下拉网页查看序列详情，物种分类，基因名称，序列位置。
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