evagreen 数字PCR之Evagreen染料法

用于数字聚合酶链反应的Evagreen染色法

EvaGreen是一种具有绿色激发波长的染料，它与所有dsDNA双螺旋小凹槽区域结合。EvaGreen作为新一代绿色荧光核酸染料，具有以下三个优点:

1.对聚合酶链反应的抑制作用较小，因此EvaGreen可以在实验中使用快速的聚合酶链反应温度循环和较高的浓度，这样可以提高亮度，消除“染料再分布”；

2.稳定性强，在储存、操作和PCR过程中不会被破坏，可反复冻融；

3.细胞膜通透性降低，更安全。

染料dPCR实验的反应体系包含一对扩增靶序列特定片段的PCR引物和扩增产物的EvaGreen染料。

EvaGreen实验步骤如下:

1.引物和扩增子设计

引物设计的原理在qPCR和数字PCR中是一样的。具体设计原则可以参考前面公布的引物探针设计原则。

2.实验准备

对于任何数字聚合酶链反应实验，有必要准备:

数字聚合酶链反应仪及专用耗材

聚合酶链反应混合物含有酶、脱氧核糖核酸、缓冲液和镁离子

Evagreen

dH2O

常见的聚合酶链反应实验用品:管片式振荡器离心机等。

3.反应体系

混合根据以下反应系统进行配置:

4.反应条件

*:根据实验引物的Tm值

5.数据收集

根据所使用的系统，数据采集将采用芯片成像(Naica系统、QuantSTudio 3D数字聚合酶链反应系统、CONSTELLATION数字聚合酶链反应系统……)或类似于流式细胞术(QX200液滴数字聚合酶链反应系统、雨滴数字聚合酶链反应系统)的形式，并将逐个读取分区。按照制造商的说明执行此步骤。

6.数据分析

在EvaGreen数字PCR实验中，只需要检查一个荧光通道，因此数据将表示为一维点图。每个点代表一个分区，Y轴代表蓝色检测通道中每个分区的荧光强度，X轴代表分析软件分配给每个分区的指数。

6.1数据质量控制

根据数据采集的类型，数据分析软件可以提供不同的质量控制。应该仔细考虑两个标准:

NTC:NTC只使用负液滴

液滴总数:大量可分析的分区将减少与测量浓度相关的不确定性

在Naica系统上，您还可以可视化生成的分区:

6.2阈值设置

通常，阈值由分析软件自动设置，高于阈值的分区为正，低于阈值的分区为负。因此，设定阈值是数字PCR处理定量结果的强制性步骤。由于阈值设置是自动计算的，我们建议您查看点一维地图。但是，以下两种情况需要手动设置阈值:

●当正分区很少或负分区很少时；

●当你在正负分区之间观察到大量雨滴时。

6.3浓度计算

设置阈值后，软件会自动量化每个目标的正分区和负分区的数量。然后，使用泊松分布将该数字读数转换成拷贝数。每个结果都有95%的置信区间，这反映了测量的准确性。这种方法的准确性也可以用“95%置信区间”的值来给出，越小越好！每个样品浓度的95%置信区间及其相对不确定度由分析软件自动计算。如图:

Evagreen数字PCR实验具有设计简单、条件建立快速、成本低廉等优点。然而，由于与埃瓦格林结合的DNA与双链DNA的结合是非特异性的，所以埃瓦格林方法主要用于低通量和单倍实验。