【弓形虫症状】动物源性食品中寄生虫的检测——弓形虫

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种可以感染的专业细胞内寄生原虫，包括特异性宿主、几乎所有动物和人-机体内的各种核细胞，人和动物的感染率都很高。

猪暴发弓形虫病（toxoplasmosis）时，可使整个猪场发病，病死率高达60%以上，造成巨大的经济损失，严重影响养殖业的发展。猪弓形虫病与公共卫生有着密切关系，猪肉是人们生活中最主要的动物源性食品，弓形虫感染的猪及其肉制品是人类感染弓形虫的一个重要传染源，对人类健康构成极大的威胁。

1 病原学特征

1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼斯的啮齿类梳趾鼠体内发现弓形虫这一病原体，并正式命名。刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T.gondii）简称弓形虫，属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoasida）、真球虫目（Eucocciida）、肉孢子虫科（Sarcocystidae）、弓形虫属（Toxoplasma）。目前，大多数学者认为弓形虫只有一个种，一个血清型，但有不同的虫株。

弓形虫的有性繁殖发生在终末宿主猫科动物小肠上皮细胞，无性繁殖发生在中间宿主温血动物除红细胞外的有核细胞。弓形虫发育全过程一般包括滋养体（又称速殖子）、包囊、裂殖体、配子体和卵囊5种形态，分别在中间宿主和终末宿主体内完成。速殖子呈弓形、月牙形或香蕉形，一端偏尖，另一端偏钝圆，平均大小为（4～7）μm×（2～4）μm。卵囊见于猫科动物，呈椭圆形，大小为（11～14）μm×（7～11）μm。包囊呈卵圆形或椭圆形，直径5～100μm。

猫吞食了弓形虫的包囊或卵囊，虫体释放出来，一部分经淋巴和血液循环被带到全身各脏器和组织中，侵入有核细胞，另一部分虫体在小肠上皮细胞进行类似球虫发育的裂殖生殖和配子生殖，产生卵囊。卵囊随粪便排出，在外界发育为具有感染性的孢子化卵囊。中间宿主食入或饮入被孢子化卵囊污染的食物和水源后，孢子化卵囊释放出子孢子，经淋巴和血液进入组织器官，侵入有核细胞而形成感染。如果感染的虫株毒力很强，而且宿主又未能产生足够的免疫力，即可引起弓形虫病的急性发作；反之，如果虫株的毒力弱，宿主又能很快产生免疫力，虫体转入慢殖子阶段，在包囊内缓慢增殖，形成持续感染。

2 流行病学特征

弓形虫病是一种世界性流行的人畜共患病，动物和人的感染均极普遍，至少有200种哺乳动物感染。感染源主要是病人、病畜和带虫动物，其中血液、肉、内脏等都可能有弓形虫。乳汁、唾液、痰、尿和鼻等分泌物中含有弓形虫；流产胎儿体内、胎盘和羊水中均有大量的弓形虫的存在。该病感染率没有严格的地区和季节性分布，但秋冬季节和早春发病率最高，可能与动物机体的抵抗力有关。全世界每年约有十几亿人感染弓形虫病，其感染率与当地居民的文化、饮食习惯等有关，国外人群感染率为0.6%～94%，平均为25%～58%，其中欧美地区弓形虫感染率较高，法国是流行最严重的国家，感染率为80%～90%；荷兰人群感染率也较高，达40%；非洲和拉丁美洲的感染率也较高；东南亚、北美洲和大洋洲的感染率则较低。我国弓形虫的发现在亚洲是较早的。新中国成立前我国无弓形虫病报道。1964年谢天华在江西首次报道了人弓形虫病。我国几乎每个省份都有人弓形虫病的报道，感染率为0.09%～34%，平均感染率为7.88%，各种年龄阶段的人均可感染，少数民族地区感染率可能更高，虽然我国人群弓形虫感染率低于世界平均水平，但呈现逐年上升趋势。

弓形虫在家畜中流行很普遍，猪、羊、牛、马等均可感染，对猪的危害最大，国外报道，该病多在3～4月龄的仔猪中发生，其症状与猪瘟类似，病死率可高达30%～40%，其中以乳猪病死率最高，而成年猪发病较少，多数呈隐性感染或出现轻微的症状。1955年于恩庶等首先在福建从猫、猪等动物体内分离出弓形虫，1977年吴硕显在上海首次从“无名高热”猪体内分离出弓形虫，证明我国存在猪弓形虫病的暴发流行。我国猪弓形虫的感染率为4%～71.4%，不同品种、年龄和性别的猪都可发病，7～9月龄发病较多，以25kg以上的育肥猪发病率最高，猪月龄对感染率高低没有一定的规律性，而性别差异较大，母猪感染率为36.4%，公猪感染率为29.4%，根据流行形式可分为暴发型、急性型、零星散发和隐性感染。

我国其他动物的弓形虫感染也非常普遍，猫的感染率为15%～73%，犬的感染率为3%～33%，羊的感染率为10%～50%，牛的感染率为0.2%～43.3%。家禽也有弓形虫的感染，鸡、鸭、鹅的感染率分别是15.69%、3.84%和16.54%。

3 危害

免疫力正常的人感染弓形虫后通常呈隐性感染，一般无明显临床症状，一旦机体免疫力下降或免疫功能缺陷者感染后，可引起全身反应和多器官受损，严重时造成死亡。妊娠期间感染弓形虫可引起流产、早产、死胎，弓形虫可通过胎盘感染胎儿，造成胎儿先天性感染。胎儿出生后表现为一系列中枢神经系统症状及眼、内脏的先天损害。有些新生儿出生时无特殊体征，仅表现为低体重、贫血、黄疸等，但逐渐出现抽搐、脑膜炎及癫痫等神经系统病变，可引起智力发育障碍。

动物感染弓形虫后表现生长缓慢，饲料利用率下降，生产性能低下，长期带虫，严重时死亡；造成繁殖动物生产异常，流产、死胎，造成严重经济损失。其中危害最严重的是猪。目前，我国猪弓形虫病分布十分广泛，华北、华东、东北、华中、华南、西南、西北等地区均有该病发生的报道，感染率和病死率普遍较高。猪肉是人们生活中最主要的动物源性食品，弓形虫感染的猪及其肉制品对人类健康构成极大的威胁。感染弓形虫的猪通常没有明显的临床症状，但事实上隐性感染猪的组织内可能含有弓形虫的包囊，如果烹饪时加工不当或者由于个人习惯（如喜食不熟或生肉），则可能引发人的弓形虫感染。

Mendonca等用PCR技术扩增经处理的猪肉香肠样品，同时以处理的猪肉香肠样品进行小鼠动物试验，以IFA检测小鼠血清中的特异性抗弓形虫抗体，结果PCR的检出率为47.14%（33/70），小鼠血清为阴性，虽然结果表明猪肉香肠样品中不含有活的弓形虫，但PCR检出率高也能说明猪肉香肠受弓形虫污染较严重。如果香肠在加工过程中食盐浓度＜3.0%，盐渍时间＜3d，则不能有效杀死香肠中弓形虫包囊或速殖子。韩国于1997年暴发的2起共8人食源性急性弓形虫病均因食用未加热透彻的（野）猪的脾和肝引起。Dias等调查巴西隆德里纳市47份屠宰工人血清和149份（8个厂家）新鲜猪肉香肠进行小鼠生物学试验，结果发现血清阳性率分别为59.6%（28/47）和8.7%（13/149），认为新鲜猪肉香肠在弓形虫病传播中有重要作用。

4 诊断技术

根据临床症状、病理变化和流行病学做出初步诊断，确诊必须在实验室中查出病原体或特异性抗体，主要方法有病原学检查、血清学检测和分子生物学诊断。

4.1 病原学检查

4.1.1 直接涂片

取血液、血清、腹水或肝、肺、淋巴结等病料直接涂片吉姆萨或瑞氏染液染色，镜检，发现虫体可确诊。此法诊断弓形虫病非常准确，但检出率低，易漏检。

4.1.2 组织切片染色法

对病变组织进行冷冻切片，用免疫酶或荧光染色，不仅可以使包囊着色，还可以使散在的弓形虫速殖子及被染细胞内虫体着色，此法灵敏度高，特异性强，可提高虫体的检出率。

4.1.3 动物接种分离法和细胞培养法

将肝、肺、淋巴结等病料匀浆后，加5～10倍生理盐水混匀，过滤，离心，取上清液腹腔接种于易感动物小鼠，观察发病情况，可盲传几代，以提高检出率。这种方法有很强的敏感性和特异性，但是比较耗费时间。亦可将上述病料接种于离体培养的单层有核细胞中，细胞培养相比动物接种来说，敏感性低，但所需时间短。

4.1.4 卵囊检查法

将粪便用饱和氯化钠或蔗糖溶液（30%）漂浮，收集卵囊镜检，但检出率一般较低。

4.2 血清学检测

血清学检测由于快速、准确、经济，已成为目前应用广泛、发展快速的检测弓形虫感染的方法。主要方法包括：染色试验、间接红细胞凝集试验、ELISA、间接免疫荧光试验、补体结合试验和免疫胶体金技术等。

4.2.1 染色试验（DT）

弓形虫速殖子、补体辅助因子和待检血清一起置37℃孵育1h，然后以亚甲蓝染色，当有特异性抗体存在时，寄生虫膜通透性增加，胞质流出，速殖子不能与染料结合而呈无色；当无特异性抗体存在时，速殖子能吸附染料而呈蓝色。该方法为经典的弓形虫病血清学检测，具有良好的特异性、敏感性和重复性。但该方法由于在检查时必须使用活的、有毒力的速殖子而存在巨大的危险性，应用受到一定的限制。

4.2.2 间接红细胞凝集试验（IHAT）

将速殖子可溶性抗原吸附于红细胞表面，再与相应的抗体发生反应，通过抗原与抗体的特异性反应，使红细胞间接凝集。Jacob和Lunde于1957年首先将该法应用于弓形虫病检测。我国于恩庶于1979年将IHAT应用于猪弓形虫病的检测。1982年，中国农业科学院兰州兽医研究所研制出IHAT诊断试剂盒。Wilson等应用ELISA、IHAT和IFAT三种试剂盒，对100份血清标本进行检测以后认为，IHAT对急性感染早期血清缺乏敏感性。崔兆君等认为IHAT特异性高、假阳性率低、诊断价值高和操作简便，缺点是敏感性不如ELISA，重复性较差，致敏红细胞不稳定，阳性判断标准带有一定的主观性。

4.2.3 ELISA

用速殖子可溶性抗原包被酶标板，加入待检血清，再滴加酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗绵羊IgG），利用酶的催化作用和底物放大反应原理，对待检抗体进行定性和定量分析。1976年，Voller等首次将该方法应用于检测弓形虫特异性抗原，获得与DT和IHAT良好的符合率，且敏感性强。Peter等用弓形虫速殖子粗体抗原建立间接ELISA检测猪弓形虫病，以DT方法做比较，结果间接ELISA的敏感性和特异性都为94%。

近年来随着分子生物学技术的应用，重组抗原取代天然抗原作为诊断抗原，省去抗原制备的繁琐过程，从而达到经济、特异和安全的目的。Redlich等用表达的融合蛋白GRA6-GST建立ELISA，其敏感性可达98%；Aubert等将重组的棒状体蛋白1（ROP1）、表面抗原蛋白（P25和P35）混合建立ELISA，用于弓形虫IgM的检测，其敏感性、特异性及符合率分别为93.1%、95.0%和94.5%，可用于弓形虫早期诊断；Huang等以表面蛋白P22（SAG2）建立ELISA，与IHAT做比较，发现该方法特异性强、敏感性高。国内吕斌等以重组的P35-GST建立了检测人血清的IgM的ELISA，该方法能区分弓形虫病的急性感染和慢性感染。张东林等建立了可检测多种动物弓形虫抗体的AG-ELISA，检测了人工感染的猪和自然感染的4种动物（猪、牛、猫和犬）的血清中抗弓形虫抗体，表明AG-ELISA阳性检出的时间比改良凝集试验方法早，其检出率、敏感性及准确度等均优于乳胶凝集试验。

总之，该方法操作易自动化，具有高度特异性和敏感性，结果可定量，适于批量样品的检测，有很好的推广应用价值。

4.2.4 间接荧光抗体试验（IFAT）

以速殖子为抗原，与被检稀释血清一起孵育，加入荧光素（异硫氰酸荧光素）标记的二抗，在荧光显微镜下观察结果。Miller等采用此法检测经免疫组化和病原学分离的28例阳性和46例阴性者的血清，发现其敏感性和特异性分别为96.4%和67.3%。该方法用于弓形虫早期感染中IgM和IgG抗体检测，具有较高敏感性、特异性和重现性等优点，但类风湿因子可引起IgM抗体的假阳性反应。因试验需要荧光显微镜观察，限制了该法的广泛使用。

4.2.5 免疫胶体金技术（ICT）

ICT是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。王艳华等建立ICT检测弓形虫血清，并与IHAT做比较，结果符合率为82.5%，ICT比IHAT能提前2d检测到弓形虫抗体，说明ICT的敏感度高于IHAT。日本带广畜产大学以重组SAG2抗原建立快速免疫层析试验检测猫体内刚地弓形虫抗体。结果证明ICT是一种快速、简便、敏感（敏感度可达到ELISA的水平）和特异的，适用于现场诊断弓形虫特异性抗体的有效工具。

4.2.6 乳胶凝集试验（LAT）

以乳胶微粒作为载体的凝集反应，于恩庶等指出LAT用于检测弓形虫感染初期敏感性好。陈亚棠等认为LAT具有操作简单、采血量少和结果稳定而易于观察等优点，适用于大规模血清流行病学调查。伦敦公共卫生实验室把LAT作为常规过筛试验，假阳性率为1%～2%。江涛采用重组弓形虫微线体蛋白3的乳胶凝集试验（rMIC3-LAT）检测人工感染弓形虫试验猪血清特异性抗体的动态变化，同时与IHAT和ELISA做比较，发现LAT的敏感性较IHAT高，检测抗体的时间较ELISA早，并且检测的时间范围较宽。

总之，LAT具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简单、结果易于判定的特点，而且既可用于早期诊断，又可用于抗体的监测，适合现场检测和大规模血清流行病学调查。但判断有一定的主观因素，不能做定量分析。

4.2.7 补体结合试验（CFT）

Nicolan和Rovello首次应用该试验诊断弓形虫病。Ondriska等认为其是检测弓形虫感染的可靠指标，特别是在检测个体样品时，如果CFT与IgM或IgA抗体水平相结合或者与亲和IgG抗体水平相结合能够更客观地反映病程。该试验对牛、山羊等某些动物不适用。

4.3 分子生物学诊断

目前，国内外已经建立多种弓形虫病基因诊断方法，主要有PCR与DNA探针技术，具有操作简单、快速、特异和灵敏等优点。

4.3.1 PCR

应用于PCR检测的靶基因主要有B1基因、P30（SAG1）基因、ITS1、rDNA（18S rRNA和5.8S rRNA）及529bp重复序列。B1基因是一种多拷贝基因，且序列高度保守，是目前最为理想的检测基因。Burg等于1989年首次以B1基因作为PCR的靶基因，已成功地从细胞裂解物中检出仅含的1条弓形虫；李建等选择B1基因作为靶基因，将PCR检测全血DNA与ELISA检测血清IgM进行比较，结果PCR阳性的最早检出时间早于ELISA，可用于弓形虫病的早期诊断。谢德华等以弓形虫核糖体DNA第一内转录间隔区（ITS1）序列建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法，该方法最低能检测到10条弓形虫速殖子的DNA，且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应。余莉等用529bp重复序列作为靶基因，建立猪肉PCR检测方法，每10g猪肉能检测100个速殖子，而B1基因每10g猪肉能检测1000个速殖子，其敏感性是B1基因的10倍。

为提高试验的敏感性和特异性，在普通PCR基础上，发展了巢式PCR、套式PCR、RT-PCR等。Johnson等根据SAG1基因设计了两对引物，先用DS29和DS30引物对扩增，再用DS38和DS39引物对进行第二次扩增，其敏感性可达0.05pg弓形虫DNA。陈晓光等建立巢式PCR，最低可检测出1pg的弓形虫DNA；Sawa等用巢式PCR检出了0.05pg的P30DNA，理论上相当于一个速殖子的基因组DNA；Ana Hurtado等建立的单管套式PCR检测方法，所得的结果与用IFAT所得的结果基本一致，而且敏感性达到0.1pg弓形虫RH株DNA。

4.3.2 环介导等温扩增（LAMP）

LAMP是Notomi等于2000年报道的一种新的核酸扩增技术，它通过BstDNA聚合酶进行链的自动循环代替DNA经典合成。LAMP只需要在等温条件下（63～65℃），30～60min就可以合成10～20μg的DNA，与PCR相比，不需要染色，肉眼就可以观察结果。杨秋林等根据弓形虫特异性基因B1的基因序列设计一套用于LAMP的特异性引物，试验显示出较好的特异性与敏感性。Zhang等用弓形虫的529bp的高度保守的重复序列设计LAMP引物，敏感性达85.7%，而PCR敏感性为76.9%。Krasteva等运用弓形虫单拷贝基因SAG1设计LAMP引物扩增弓形虫DNA，与PCR相比更敏感。Sotiriadou等用LAMP扩增弓形虫B1和OWP基因检测水体弓形虫，可以检测到0.1个速殖子。

4.3.3 DNA探针

Blanco等建立了RH株弓形虫基因文库，筛选出一个重复片段，用32P标记作为探针，斑点杂交可检测到80pg以上纯化弓形虫DNA。夏爱娣等也建立了弓形虫人株（ZS-2）株弓形虫基因文库，筛选了一个1.1kb特异性DNA片段并用32P标记作为探针检测弓形虫，敏感度为500pg纯化弓形虫DNA。Angel等采用ABGTg7标记的探针杂交检测急性弓形虫脑炎病人DNA，敏感性为66.7%。目前用于弓形虫检测的探针多为特异性DNA克隆片段或人工合成的寡核苷酸探针，虽然敏感性高，但其制备需要一定条件，且费用较高，不易推广。

分子生物学诊断是非常敏感和特异的方法，但其对试验环境和操作者技术要求高，有许多因素影响其结果，且费用较高不利于普及。在实际操作中还是以血清学检测为主。