荧光pcr检测方法 常见荧光定量PCR检测方法比较

定量PCR:以参考为标准，对PCR的最终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而评估样品中目的基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性一般在PCR扩增的指数期进行量化。

常用荧光定量聚合酶链反应方法的比较

SYBR绿色一检测模式

SYBR Green I是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量有关，根据荧光信号可以检测出PCR体系中双链DNA的数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，最大发射波长约为520nm。聚合酶链反应扩增程序一般为三步法，在94℃ ~ 55℃ ~ 72℃下循环40次。SYBR Green I的缺点:由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链，就会结合发光，在PCR反应中也会对非特异性扩增或引物二聚体产生荧光，通常背景较高，所以临床使用中可能会有假阳性。

SYBR Green I的优点:SYBR Green I的优点是可以结合所有的双链DNA，因此不需要针对不同的模板定制不同的特异性探针，通用性好，价格相对较低。这对于科研是非常有利的，所以在国内外的科研中都有广泛的应用。

SYBR格林我工作原理

水解探针模式

TaqMan探针是寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’端，淬灭剂在3’端。当探针与靶序列配对时，荧光团发出的荧光被淬灭，因为它在3’端接近淬灭剂。在延伸反应中，探针被聚合酶的5’核酸外切酶活性切断，从而荧光基团从淬灭剂中分离出来并发出荧光。分子产物的产生伴随着分子荧光信号的产生。随着扩增周期的增加，释放的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测累积的荧光。聚合酶链反应扩增程序通常在94℃ ~ 60℃下进行40个循环。常用的荧光基团有FAM、TET、维克和HEX。

Taqman工作原理

杂交探针模式

分子信标是发夹状的茎环双标记寡核苷酸探针，两端核酸序列互补配对，因此一端标记的荧光基团接近另一端标记的淬灭基团。荧光基团激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，荧光基团产生的能量以红外而不是可见光的形式释放出来。在分子信标的茎环中，环一般为15-30个核苷酸长，与靶序列互补；茎通常有5-7个核苷酸长，彼此配对形成茎结构。荧光团标记在探针的一端，而淬灭剂标记在另一端。在复性温度下，模板不存在时形成茎环，模板受热变性时互补的成对茎环双链会被解开。如果模板存在，循环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将呈链状而不是发夹状，从而使荧光基团与淬灭剂分离。当荧光团被激发时，猝灭效应被释放，激发光子被发射。因为酶消化，分子信标也积累荧光。常用荧光组:FAM，德克萨斯红。聚合酶链反应扩增过程通常在94 ~ 55 ~ 72℃下分三步进行，共40个循环。

分子信标的工作原理

FRET探针，也称为双杂交探针，由两个相邻的探针组成，其中一个在5’端用FAM荧光团标记，另一个在3’端用红色640荧光团标记。复性时探针与模板结合，FAM基团与Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，被吸收为Red640基团的激发光，使得Red640发出波长为640的荧光。变性时探针自由，两组距离较远，不能产生640波长的荧光。FRET探头在附近发光，所以检测信号是实时信号，不是累积信号。常用的荧光基团有LC-Red640和LC-Red705。

实时荧光PCR定量方法有很多种，每种方法都有其优缺点，我们应该根据实验的需要和目前的实验条件选择自己的方法。以下是各种方法的比较:

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