石正丽新研究:需持续监控蝙蝠 究竟发生了什么?

石和其他中国科学家发现，进化的“军备竞赛”塑造了病毒及其受体的多样性。识别参与种间传播的关键残基对于预测潜在的病原体和理解病毒如何从野生动物转移到人类非常重要。

此前，研究人员已经在中国菊蝠中鉴定出具有不同遗传特征的SARS相关冠状病毒。最新的研究也显示了中华菊蝠种群中蝙蝠受体ACE2的高度多样性。这些ACE2变异体支持SARS病毒和SARS相关冠状病毒的感染，但对不同的尖峰蛋白有不同的结合亲和力。SARS相关冠状病毒尖峰蛋白对人ACE2具有较高的结合亲和力，表明这些病毒具有向人类转移的能力。ACE2和SARS相关冠状病毒尖峰蛋白界面残基的正向选择表明它们之间存在长期持续的共同进化动力学。因此，持续监测蝙蝠体内的这一组病毒对于预防下一次类似SARS的疾病是必要的。

以上研究来源于中国科学院武汉病毒研究所石、福建师范大学生命科学学院欧阳松英教授在预印平台bioRxiv上发表的论文《病毒与宿主的进化军备竞赛驱动蝙蝠SARS相关冠状病毒穗状基因的遗传多样性》。

中华菊蝠是SARS病毒的宿主，也携带多种SARS相关冠状病毒。这些病毒具有很高的遗传多样性，尤其是病毒的尖峰蛋白基因。虽然有不同程度的变异，但部分蝙蝠SARS相关冠状病毒仍可利用人类受体ACE2进入人体细胞。研究人员推测，蝙蝠的ACE2受体与SARS相关冠状病毒的尖峰蛋白之间存在相互作用，驱动了SARS相关冠状病毒的遗传多样性。

研究人员鉴定了中国蝙蝠的一系列ACE2变体，其中有一些多态性位点与SARS-CoV尖峰蛋白相互作用。携带不同尖峰蛋白的伪病毒或SARS相关冠状病毒在表达bat ACE2变异体的细胞中具有不同的瞬时感染效率。通过测定SARS病毒和SARS相关冠状病毒的刺突蛋白与bat受体和人受体分子的结合亲和力，可以观察到相关结果。

所有测试的蝙蝠传染性非典型肺炎相关冠状病毒尖峰蛋白与人血管紧张素转换酶2的结合亲和力均高于蝙蝠血管紧张素转换酶2。而SARS相关冠状病毒尖峰蛋白与人ACE2的结合亲和力比SARS-CoV尖峰蛋白与人ACE的结合亲和力低10倍。

结构建模表明，尖刺与ACE2结合亲和力的差异可能是由这两种分子界面上一些关键残基的变化引起的。分子进化分析表明这些残基处于强正选择状态。

这些结果表明，SARS-CoV-2尖峰蛋白和bat ACE2可能随着时间的推移而相互进化，并经历彼此的选择压力，从而触发进化的“军备竞赛”动力学。这进一步证明了中华菊蝠是SARS相关冠状病毒的天然宿主。

冠状病毒是一种包膜病毒，含有单链正链RNA。该亚科有4个属，即α、β、γ和δ。α冠状病毒和β冠状病毒起源于蝙蝠或啮齿动物，而γ冠状病毒和δ冠状病毒起源于鸟类。自21世纪初以来，三种β冠状病毒引起了人类严重的肺炎爆发。它们是SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。

SARS-CoV-2引发的疫情，让人想起17年前的非典疫情。非典是一种人畜共患疾病。在接下来的几年里，科学家们从中国和欧洲不同地区的蝙蝠身上检测或分离出了75种具有不同遗传特征的SARS相关冠状病毒。

蝙蝠SARS相关冠状病毒与人和果子狸的SARS-CoV有96%的核苷酸序列相似性，最易变的区域是棘蛋白和辅助蛋白ORF3和ORF8。此外，研究人员还在不同的蝙蝠SARS相关冠状病毒基因组中鉴定出SARS-CoV的所有基因构件，表明SARS病毒的祖先是通过蝙蝠SARS相关冠状病毒基因组重组的，起源于蝙蝠。

病毒感染的第一步是识别细胞受体，这也是必不可少的一步。冠状病毒的进入是通过病毒刺突蛋白与细胞表面受体的特异性相互作用介导的，然后病毒与宿主膜发生融合。冠状病毒的尖峰蛋白可分为两个亚单位:细胞附着亚单位和膜融合亚单位。S1区域包含n端域和c端域。两者都可以用于冠状病毒受体结合。

对于SARS-CoV，SARS-CoV的S1-CTD如同RBD一样，与细胞的受体即血管紧张素转换酶2结合。通过冷冻电镜和晶体结构分析，鉴定了SARS病毒S-RBD与人血管紧张素转换酶2界面上的一些关键残基。

根据S蛋白的大小，蝙蝠SARS相关冠状病毒可以分为两个不同的进化分支。进化分支1中包含的病毒具有与SARS病毒大小相同的尖峰蛋白。但由于缺失了5、12或13个氨基酸，属于进化分支2的病毒的尖峰蛋白比SARS病毒的小。

虽然RBD不同，但所有的分支杆菌1菌株都可以使用ACE2进入细胞，而分支杆菌2菌株由于上述缺失不能直接进入。这些结果表明，就基因组相似性和ACE2的使用而言，支序1的成员可能是SARS病毒的直接来源。

ACE2在功能上分为两个结构域:N端结构域参与SARS-CoV结合，C端结构域参与心脏功能的调节。以往的研究结果表明，不同来源的ACE2的碳末端结构域相对保守，而氮末端结构域在物种间表现出更大的多样性。此前已经证明SARS病毒可以利用中国鼻翼动物的ACE2和中国鼻翼动物的ACE2。RBD结合位点的微小突变可以使ACE2从对SARS-CoV结合不敏感变为易感。既然属于千里眼1号的SARS相关冠状病毒都可以从中华菊蝠中提取出来，ACE2也可以使用，那么研究人员就提出疑问，中华菊蝠ACE2的变异是否可能导致蝙蝠体内SARS相关冠状病毒的多样性。

研究小组研究了中国蝙蝠菊ACE2基因的多态性，通过分子进化分析、蛋白亲和分析和病毒感染分析，评价了它们在不同蝙蝠中对SARS相关冠状病毒尖峰蛋白的敏感性和结合亲和力。

结果表明，SARS相关冠状病毒穗蛋白的多样性可能受到中国菊蝠ACE2变异体的自然选择压力；在长期共存时期，中国菊蝠ACE2可能会选择SARSr-CoV穗蛋白，以保持其自身的遗传多样性，并适合中国菊蝠群体。

ACE2基因在中华菊头蝠种群中表现出高度多态性

根据SARS相关冠状病毒在蝙蝠中的流行程度以及样本组织的可获得性和质量，研究人员使用来自三个省份的样本来扩增ACE2。

除了bat ACE2和团队先前测序的其他bat ACE2之外，研究人员还从中国菊蝠的21个个体中获得了ACE 2基因序列:湖北5个，广东9个，云南7个。这些蝙蝠ACE2序列在其物种中显示98-100%的氨基酸同一性，并且与人类ACE2显示80-81%的氨基酸同一性。

在这些蝙蝠的乙酰胆碱酯酶2的氮末端区域观察到了主要的变化，包括一些以前被确定与非典病毒的RBD病毒接触的残基。通过非同义SNP分析鉴定了8个残基，包括24、27、31、34、35、38.41和42。这8个残基组合产生了8个等位基因，包括RIESEDYK、LIEFENYQ、RTESENYQ、RIKSEDYQ、QIKSEDYQ、RMTSEDYQ、EMKT KDHQ和EIKT EIKTKDHQ，分别命名为等位基因1-8。

除了先前研究中ACE2基因型的数据之外，研究人员还在中国仓鼠种群中发现了五个新的等位基因。等位基因2在两个省的样本中发现，等位基因4在三个省发现，而其他等位基因似乎受到地理限制。总之，广东有3个等位基因，云南有4个等位基因，湖北有3个等位基因，广西和香港有1个等位基因。在发现SARS病毒直接祖先的云南一个蝙蝠洞，研究人员发现4个等位基因共存。

综上所述，这些数据表明ACE2变异体在不同地区的羊草种群中已经存在了很长时间。与非典病毒的RBD病毒直接接触的位点的替换表明它们可能在非典病毒的进化和传播中起重要作用。

羊栖菜ACE2变异体对SARS相关冠状病毒感染表现出不同的敏感性

为了评估不同的中华菊头蝠ACE2分子是否会影响SARS病毒和蝙蝠SARS相关冠状病毒的进入，研究者在HeLa细胞中瞬时表达了中华菊头蝠的ACE2的变体，并测试了携带不同刺突蛋白的SARS病毒伪型或蝙蝠SARS相关冠状病毒的进入效率。

蝙蝠中的4株SARS相关冠状病毒根据S1序列可分为4个基因型。简单来说，与SARS病毒的尖峰蛋白相比，SARS相关病毒RsWIV1的RBD蛋白与SARS病毒具有较高的氨基酸同一性；RsWIV16是SARS病毒的近亲，在NTD和RBD表现出高度的氨基酸相似性；Rs4231与with SARS病毒具有高度的氨基酸相似性。RsSHC014不同于NTD和RBD地区的非典病毒。

与之前的研究结果类似，基因组背景相同但尖峰蛋白不同的4株bat SARS相关冠状病毒株，都可以利用人ACE2进行相似水平的复制。

但是中华菊蝠的ACE2在使用方法上有一定的差异。所有被测病毒都可以有效利用等位基因1、2、4、5进入。RBD相同的RsWIV1和RsWIV16不能使用广东的等位基因6(样本号1434)。具有相同RBD的Rs4231和RsSHC014不能分别使用来自云南和广东的等位基因7(样本号3357)和等位基因8(样本号1438)。SARS BJ01与WIV1和WIV16的RBD具有高度相似性，在假型感染实验中可以使用与Rs4231和RsSHC014相同的bat ACE2等位基因。

这些结果表明，病毒进入细胞受到RBD和中国菊bat ACE 2变异体的影响。

bat中ACE2残基的突变将影响其与SARS相关冠状病毒RBD的结合亲和力

为进一步了解SARS病毒和SARS相关冠状病毒对ACE2使用能力不同，研究者表达了冠状病毒BJ01、RsWIV1、RsWIV1、RsSHC014的RBD，和3个中华菊头蝠的ACE2，分别是等位基因6(样本1434)，等位基因7(样本3357)和等位基因2(样本5720)。

然后，研究人员测试了它们之间的亲和力。非典病毒RBD株BJ01和人ACE2为阳性对照，非典病毒RBD株RsWIV1和人DPP4为阴性对照。实时分析表明，基于平衡解离常数KD，不同RBD与ACE2的结合亲和力不同。

与病毒感染的实验结果一致，发现1434ACE2(等位基因6)与RsSHC014和BJ01结合，而与RsWIV1的RBD不结合。研究还发现，3357ACE2(等位基因7)与RsWIV1结合，但与RsSHC014和BJ01的RBD不结合。发现5720的Ace2(等位基因2)结合所有测试的rbd。所有测试的红细胞都与人或蝙蝠ACE2有很高的结合亲和力。然而，与蝙蝠体内两种SARS相关冠状病毒的RBD株相比，它与中国菊蝠ACE2的结合亲和力较低。

这些结果表明，RBD和乙酰胆碱酯酶2之间的结合亲和力影响病毒的传染性。

中国菊蝠冠状病毒RBDs与ACE2s相互作用的结构模型

4个蝙蝠SARS相关冠状病毒的刺突蛋白大小相同，与SARS-CoV的氨基酸同源性超过90%，表明这些蛋白具有228个相似的结构。在本研究中，他们使用中华菊头蝠ACE2 3357（等位基因7)构建了蝙蝠SARS相关冠状病毒RsSHC014 RBD的结构复杂模型，并用中华菊头蝠ACE2 1434(等位基因6)构建了蝙蝠SARS相关冠状病毒RsWIV1 RBD的结构复杂模型。

这与SARS-CoV RBD病毒与人ACE2结合亲和力的实验结果一致。与SARS-CoV RBD与人ACE2界面的接触残基相比，可以观察到ACE2上的两个病毒结合热点(热点Lys31和Lys353中分别由Glu35和Asp38组成的盐桥)。如前所述，这两个热点隐藏在疏水环境中。它们为病毒-受体结合相互作用提供了大量能量，填补了结合界面上疏水叠加238相互作用的关键空缺口。

与人类ACE2相比，中国蝙蝠ACE2-3357的两个主要残留变化是E35K和Y41H。RsSHC014 RBD中E35K与K31和Arg479之间的盐桥被破坏，这可能影响它们的结合亲和力。第41位的组氨酸可能会削弱K353- d38盐桥的支持力，因为组氨酸的疏水性不如酪氨酸，导致其与BJ01 RBD的结合亲和力降低。因此，BJ01和RsSHC014 RBD与中国菊bat ACE2 -3357的结合亲和力较低。

苏氨酸发现于中国菊bat ACE2-1434的31位，与人类ACE2的这个位置不同，是赖氨酸。虽然K31T因其变化不能与Glu35形成盐桥，但BJ01的RBD c中的Tyr442可以与它形成氢键。然而，rswiw 1 RBD中442位的丝氨酸不具有这种功能。

此外，RsSHC014在479位含有一个精氨酸，Thr31不能与Glu35形成盐桥，所以Glu35可以与Arg479形成盐桥，但是Asn479，RsWIV1中的RBD残基，可能导致其失去这种能力。所以BJ01和RsSHC014 RBD可以和ACE2 -1434结合，RsWIV1RBD不能和ACE2 -1434结合。

在本研究中，所有中国菊蝠的ACE2在82位含有一个天冬酰胺，而人类ACE2在这个位置是甲硫氨酸。M82N的变化引入了不利的亲水残基，这削弱了热点31周围的疏水网络。另外，Asn82引入了一个糖基化位点，就像大鼠ACE2一样，导致其无法有效支持SARS-CoV感染；ACE 2 82位的聚糖可能导致空和病毒RBD结合之间的干扰。

因此，M82N可能对SARS-CoV与SARS相关冠状病毒RBD和ACE2s的相互作用有显著影响。如前所述，RBD残基487与ACE2上的热点353相互作用。RSWI 1 RBD含有Asn487，Asn487的极性侧链可能与ACE2中Lys353残基的脂族部分发生不利的相互作用，从而影响K353和D38之间的热点相互作用。

此外，RsSHC014 RBD在487位含有一个丙氨酸；Ala 487的小侧链不支持热点353的结构。因此，RsWIV1和RsSHC014 RBD与人ACE2的结合亲和力低于BJ01，但与人ACE2的结合亲和力高于中国菊bat ACE2，这与病毒感染和结合实验结果高度一致。

通过正选择与中国菊蝠ACE2共进化

为了测试作用于SARS病毒刺突蛋白和中华菊头蝠ACE2基因可能存在的选择压力，他们使用PAML软件包的编码ml程序来分析单个密码子的非同义突变与同义突变的比值(dN/dS比值)。通过分析了完整的编码SARS相关冠状病毒刺突蛋白的基因序列，并比对了来自中华菊头蝠样本的9个SARS相关冠状病毒刺突蛋白的基因序列。

发现该模型允许正选择(M2a和M8)下的密码子进化。在M8模型(初始种子值ω(dN/dS) = 1.6，密码子频率= F3X4)中，以dN/dS > 1的比率正向选择20个密码子(p > 0.95)。根据晶体结构，298个密码子中有17个位于RBD区域，面向受体ACE2。此外，SARS-CoV尖峰中出现了5个密码子(442、472、479、480和487)，它们被确定对人ACE2的结合亲和力有显著影响。

接下来，他们比较了从基因库下载的25只中国红掌蝙蝠的ACE2基因序列，并分析了中国红掌蝙蝠的ACE2基因。他们发现在M8模型中，有12个密码子(2.3%，p > 0.95)以dN/dS > 1的比率被积极选择，其中8个密码子(31、24、27、34、35、38、41、42)对应于人ACE2的残基，这些密码子直接参与人SARS病毒的尖峰蛋白的接触。

他们还分析了亲和链球菌的ACE2基因，据报道，该基因偶尔会结合SARS相关冠状病毒。根据本研究获得的23个中华菊头蝠ACE2基因的序列比对，发现中华菊头蝠ACE2在整个编码区的不同个体间比中华菊头蝠更保守，没有观察到明显的正选择位点(数据未显示)。

此外，通过查询单核苷酸多态性(SNP)数据库，他们发现人类ACE2基因中的SNP是在整个编码区随机产生的。虽然在人类ACE2中发现了两个具有非奇异突变的SNP位点(T27A和E35K)，但它们在全球人群中均显示出罕见的频率(频率分别为0.00001和0.00002)。这些结果表明，蝙蝠体内SARS相关冠状病毒的棘蛋白与中国菊蝠体内的ACE2在界面上存在正选择。