酰基 不明觉厉！酰基-生物素交换法是个什么鬼？

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在阅读医学研究文献时，经常会看到一种不明确的研究技术，叫做“酰基-生物素交换法”，翻译过来就是“酰基-生物素交换法”。这种方法主要用于研究蛋白质的翻译后修饰。

大多数蛋白质分子具有不同的翻译后修饰机制来调节蛋白质功能。蛋白质最常见的翻译后修饰称为磷酸化，主要发生在丝氨酸、苏氨酸等残基位点，常被特异性抗体检测到。

蛋白质的翻译后修饰除了磷酸化，还有很多途径，如糖基化、乙酰化、甲基化、亚硝化、谷胱甘肽、棕榈酰等。探索蛋白质翻译后修饰的生物学意义是生命科学的研究热点之一。

就医学研究而言，如果你发现一个新报道的蛋白质翻译后修饰只是参与调节蛋白质在疾病过程中的功能变化，恭喜你，一篇好文章已经在不远处招手了。

一个

酰基-生物素交换法是检测蛋白质翻译后修饰的常用方法。由于其高反应性，蛋白质半胱氨酸残基上的巯基容易发生各种氧化还原反应或酰化反应。酰基-生物素交换法的本质是将待检测的翻译后修饰转化为酰化生物素基团。

整个交换过程应分三步完成:

第一步是阻断可能干扰检测的噪声，即其他可以被生物素酰化的氨基酸残基群；

在第二步中，将检测到的翻译后修饰特异性地转化为可以进行酰化反应的状态，如还原巯基状态或游离胺状态；

第三步，生物素与经过酰化反应翻译后可以修饰的氨基酸残基结合。这样，原始蛋白质的翻译后修饰将被酰化生物素所取代。这些生物素化的蛋白质可以通过用亲和素制备色谱柱来富集，亲和素可以选择性地结合生物素，然后通过抗体进行检测。

2

亚硝化修饰是发生在半胱氨酸残基巯基上的蛋白质翻译后修饰，对许多与心脑血管疾病相关的蛋白质功能具有重要的调节作用。

以亚硝化为例，可以帮助我们理解如何通过酰基-生物素交换来研究蛋白质的翻译后修饰。让我们来看看如何在实验室中用酰基-生物素交换法检测蛋白质的亚硝化水平。

首先，如果一个工人想做好他的工作，他必须首先磨利他的工具。不用麻烦，认真准备几个方案。

第一种叫做HEN缓冲液(11.9150gHepes羟乙基哌嗪乙磺酸。NaOH，0.0584g乙二胺四乙酸，0.004166g新松脂，加入到200 ml超纯水中)，是整个酰基生物素交换反应的基础缓冲液。

二是称为母鸡缓冲液，在母鸡缓冲液中加入一定比例的SDS(一般母鸡缓冲液和25% SDS按9:1配比)。

第三种称为裂解物，是基于第一种HEN缓冲液，每毫升体积中加入1% NP40 10 μl、蛋白酶抑制剂鸡尾酒10 μl和1 mM PMSF 10μl。溶胞产物是第一种用来破碎细胞或组织的液体。

第四种称为洗脱液，是在第二种HENS缓冲液的基础上加入DTT制备的(一般DTT的最终浓度为100-200mM)。

三

然后根据以上三个步骤，我们可以对蛋白质上亚硝化修饰的巯基进行酰基-生物素基交换反应。

第一步是阻断可能造成干扰的噪音:将细胞或组织样品按10μl/mg或500μl/孔(六孔板)加入裂解液中，在冰上超声裂解5分钟，立即在4℃下12000g离心15分钟。取上清液，加入4倍体积的封闭缓冲液。

所谓的封闭缓冲液是在每毫升HENS缓冲液中加入10微升MMTS原液(MMTS是一种特定的巯基封闭剂，用二甲基甲酰胺配制成2M原液浓度)。密封反应在50℃的恒温水箱中进行，通常需要20分钟到半小时。

第二步，亚硝化修饰的巯基转化为可进行酰化反应的游离巯基:将裂解物转移到离心管中。在离心管中一次性加入-20℃的丙酮，在-20℃静置40分钟，在5000g离心20分钟，去除上清液。

重复上述步骤三次后，获得相对纯的蛋白质。除去丙酮上清液后，向沉淀中加入用HENS缓冲液制备的维生素C (20 mM，1ml)，以溶解蛋白质并将亚硝化信号转化为酰化巯基分子。

在第三步中，生物素被酰化并与这些转化结合产生巯基。加入用HENS缓冲液制备的生物素-hpdp(1毫米，1毫升)，在室温下孵育2小时(在摇床中避光)。反应结束后，用丙酮沉淀去除反应液中的小分子，制备纯化蛋白。

将反应溶液转移到离心管中。在离心管中一次性加入-20℃的丙酮，在-20℃静置40分钟，在4℃离心20分钟，取出上清液。重复步骤三次。用2 ~ 3毫升HENS缓冲液将沉淀物完全溶解。

最后，我们还有一个关键的实验步骤，就是从一堆蛋白质中筛选出亚硝化的蛋白质用于抗体检测。别忘了，这个时候那些亚硝化修饰的蛋白质已经被酰基生物素标记的蛋白质取代了，找到它们并不困难。

我们用一个包装的亲和素-琼脂糖做亲和层析柱，这是一个很高的东西，可以把所有的蛋白和酰基生物素标签结合起来。

将溶解沉淀蛋白的HENS溶液填充到抗生物素蛋白-琼脂糖洗脱柱中，循环多次，用洗脱液冲洗柱(确保洗脱液充满整个柱)。100℃处理20分钟后，打开抗生物素蛋白-琼脂糖洗脱柱下盖，收集含有目的蛋白的洗脱液，继续用洗脱液冲洗2~3次。收集蛋白质。

酰基-生物素交换法虽然步骤复杂，但不需要专门的实验设备，成本低但力度大。基本上，能做WESTERN BLOTTING实验的实验室就能做这方面的研究。

四

而且关于疾病模型中蛋白质翻译后修饰的文章不多，比较热门，可以多关注。

注意事项:

不是所有的蛋白质都会经过亚硝化修饰。先做好文献研究。

维生素C减少的时间不宜过长。

生物素-HPDP最好配制成原液，然后分成小分支。

用丙酮沉淀蛋白质后，尽量吹干或挥发丙酮残渣。

在包装和制备过程中，抗生物素蛋白-琼脂糖洗脱柱应展平，不应产生间隙或气泡。

如果你对这项技术感兴趣，推荐几篇文献看看:

1.ffrey SR，Erdjument-Bromage H，Ferris CD，Tempst P，Snyder SH (2001)蛋白质S-亚硝基化:神经元一氧化氮的生理信号。Nat Cell Biol 3:193–197。

一种新的方法揭示了右旋糖酐在单个半胱氨酸残基上的S-亚硝基化。化学生物9:1329–1335。

3.stafa AK，Kumar M，Selvakumar B，Ho GP，Ehmsen JT，Barrow RK，Amzel LM，和Snyder SH (2007)。一氧化氮S-亚硝酰丝氨酸消旋酶，介导D-丝氨酸形成的反馈抑制。美国国家科学院学报104: 2950-2955。