10min是多长时间，干货看这篇!表面微生物测试操作规程

目的：为了准确测定清洁区的表面微生物，确保清洁区的环境符合要求，特制定本规定。

范围：适用于洁净室（区）表面微生物的测试。

职责：QC部门负责起草，QC人员、QA人员严格按规程进行检验。

依据：《药品生产质量管理规范》（2010年版）

《中国药典》（2020版四部）

1 简述

表面微生物是附着在生产区域表面及设备和与产品接触表面的活微生物粒子，用本规程中的方法收集后通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落群。

2 仪器与用具

2.1 恒温培养箱,高压灭菌器应检定合格，且在使用有效期内。

2.2 培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA)，配制详见《培养基配制操作规程》（SOP-QC-0060）。

2.3 培养皿φ55mm。

2.4 一次性医用棉签、生理盐水、三角瓶、灭菌剪刀

3 测试条件

3.1 如使用自制培养基平板，在测定前培养皿表面必须严格消毒。

3.2 如使用市售预制平板，则每进入一级洁净区，即脱掉一层包装袋，测试所用培养皿最终以无菌状态进入所测定区域。

3.3 测定状态分为静态和动态，静态测试时室内测定人员一般不超过2人，测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。

3.4 对单向流测定应在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min之后开始；对非单向流测定应在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min之后开始。

4 表面微生物测试点选择及测试频度

4.1 采样点数目及其布置应根据以下几个方便设置：

空调系统初始验证的结果；房间（或区域）的大小和布局；房间（或区域）的用途；与暴露产品的距离；人流物流方向；设备、管理等的复杂程度；易受污染的部位等；

应考虑包含以下部位：每扇门、每个门把手、地板（至少两点）、墙壁（不易被清洁、消毒的部位，至少两点）、公共介质的管路（不易被清洁、消毒部位）、生产设备的关键性部位（如灌装针、易与人员接触的塑料帘膜、胶塞筒、传输带）等。

操作人员人体表面采样点应考虑以下部位:双手手指及掌内侧、双手前臂、前胸或腹、眼镜、前额、口罩等处。

根据洁净区内设施、设备等表面对产品和洁净室环境的影响程度，通常将表面分为三类：关键表面（产品、容器及密封件的表面）、一般表面（如设备的外表面、墙壁等）和地面，并且分别设定不同的微生物限度要求。

4.2 采样次数

一般来说，对于同一洁净区或区域，每个相同的取样物体应在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点等。

表面微生物的每点采样点面积宜控制在25cm2左右。

4.3 测试频度

洁净区表面微生物测试的频率见表1。

表1 测试频率

4.4 日常监测采样点和频度见 洁净室（区）环境监测管理规程（SOP-QC-0095 01）。

5 测试方法

5.1 接触平皿法

5.1.1 接触平皿法适用于平整表面。

5.1.2采样前仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。

5.1.3 在培养皿上盖标记测定项目、测定点，日期等信息。

5.1.4 表面附着菌

5.1.4.1 打开接触板碟盖，让培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触板底板，确保培养基表面与取样点表面充分接触不少于10秒，再盖上碟盖。

5.1.4.2 取样后，立即用75%乙醇擦拭取样表面。

5.1.5 手套附着菌

5.1.5.1 打开接触板碟盖，操作者并拢五指，将双手指面与培养基表面均匀充分接触不少于10秒，再盖上碟盖。

5.1.6 取样后的接触板置于培养箱中，先30～35℃培养不少于3天，再20~25℃培养不少于2天。

5.2 棉签擦拭法

5.2.1 棉签擦拭法适用于非平整表面。

5.2.2 取100ml生理盐水放入250ml三角瓶中作为浸出液，取300ml生理盐水放入500ml三角瓶中作为洗净液，取400ml生理盐水放入500ml三角瓶中作为空白液，121℃15分钟灭菌。

5.2.3 在三角瓶上标记测定点、日期等信息。

5.2.4 取出一次性棉签，握住棉签柄，用浸出液浸湿棉头，以约30度角与取样表面接触，擦拭面积为5cm×5cm，缓慢纵横交互擦拭3遍。

5.2.5 擦拭完毕，用已灭菌剪刀剪断棉签，棉头装入100ml浸出液的三角瓶内，手持一端废弃。

5.2.6 取样后，立即用75%乙醇擦拭取样表面。

5.2.7 将上述取样后的三角瓶振摇2分钟，每分钟振摇120次，在超净工作台内通过过滤装置，将100ml浸出液全部过滤。浸出液过滤完毕，用洗净液300ml分三次冲洗过滤器，将过滤后的滤膜放入培养基平板内。用400ml空白液进行过滤，做为空白。

5.2.8 将样品培养基平板和空白样培养基平板倒置在培养箱中，先30~35℃培养不少于3天，再20~25℃培养不少于2天。

6 结果观察

6.1 培养完毕后，用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，不要漏计培养基平板边缘生长的菌落，求出平均菌落数。

6.2 另外，按规定时间培养后会出现扩散性菌落，从而使菌落记数困难。这种情况下，可以用菌落记数仪记录观察值来记数。若培养基平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。

7 结果评定

7.1 判定标准：参照相关规程执行。

7.2 每个测点的沉降菌平均浓度必须低于所规定的标准。

8 相关文件及记录：

《培养基配制操作规程》（SOP-QC-0060）

9 附件：无

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