细菌的分离纯化 微生物菌群的分离纯化、培养、鉴定及保藏

随着人们生活水平的不断提高，食品、医药、饮料、化妆品等行业都需要进行微生物检测。在微生物检测中，每个人都需要了解微生物菌群的分离、纯化、培养、鉴定和保存。今天小姐姐为大家准备了相关内容，希望对你的检测工作有所帮助。

微生物的纯培养和分离技术

获得纯培养物对微生物学研究非常重要。

纯培养是指来源于同一单细胞的细胞群。

图片来源:CICC

菌株的分离和纯化

从混合微生物群体中仅获得一种或一种微生物菌株的过程称为微生物分离和纯化。在分子生物学的研究和应用中，不仅要通过分离纯化技术从混合的天然微生物群落中分离出特定的微生物，还要保持微生物的纯培养“纯”，防止其他微生物混入。

平板涂布法

由于微生物悬液是先加入到滚烫的培养基中，然后倒在平板上，很容易造成一些热敏性细菌的死亡，而稀释倒平板法由于固定在琼脂中的氧气不足，也会影响一些严格的需氧细菌的生长，所以微生物学研究中常用的纯分离法是包被平板法。

用途:一般用于从菌种中提纯；

优点:可观察菌落特征，分离混合菌；

缺点:不能算；

条纹平板法

分离微生物最简单的方法是平板划线法，其原理是将固体培养基表面的微生物样品从点到线多次稀释，达到分离的目的。划线方法有很多，其中常见的容易出现单个菌落的划线方法有对角线法、曲线法、正方形网格法、辐射法、四格法等。

用途:一般用于筛选菌株。一般用来统计平板培养基的回收率。

优点:可以计数观察菌落特征。

缺点:吸收少，麻烦多，干燥效果差，容易扩散。如果菌液密度高，就不会长出单个菌落。

大肠杆菌的培养和鉴定

大肠杆菌能在乳糖胆盐液体培养基中生长，产生气体和酸，使培养基变色。它也可以在曙红亚甲蓝的固体培养物上生长，形成深紫色的菌落，其中一些具有金属光泽。其他致病菌的菌落是粉红色的。镜检为无芽孢革兰阴性杆菌(红色)。大肠菌群的存在是可以鉴定的。

文化保存

细菌保存是指在不污染其他杂菌的情况下，对微生物菌种进行长期保存，并保持其形态特征和生理特性，减少变异，防止老化，以方便以后使用。菌种的保存一般是选择其休眠休，如孢子；孢子等。，并产生低温；烘干；缺氧；避光、缺乏营养的环境条件有利于休眠体的长期休眠。对于不产芽孢的微生物，其代谢应该处于最低状态，不会死亡，从而达到长期保存的目的。

实验材料和设备

注意:

1.乳糖胆盐液体培养基:由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫、胆盐组成，属于液体、鉴定、增量、半合成培养基，用于实验中培养废水中的菌群；

2.曙红-亚甲蓝琼脂:含有蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、曙红-亚甲蓝和琼脂。琼脂平板用于分离纯化肠道致病菌，尤其是大肠菌群和粪大肠菌群；

3.营养琼脂培养基:含牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂。用于分离纯化菌体培养物。

实验方法和步骤

1.实验安排

实验准备；

取样、恒温培养富集和初筛；

观察产气情况，稀释，倒入培养基，划线，涂布并倒置培养物；

鉴定和接种；

菌种保存。

2.具体操作步骤

实验准备

①准备培养基(曙红亚甲蓝琼脂培养基:7.4g+200mL无菌水，调至pH 7.2 ~ 7.4，营养琼脂培养基:6.6g+200mL无菌水，调至pH 7.4±0.2，0.85%生理盐水，乳糖胆盐液体培养基2.6g+100mL无菌水，调至pH 7.4±0.2)。

(2)包扎培养皿、移液管、试管，进行干热灭菌。

③将配制好的乳糖胆盐液体培养基放入三个试管中，每个试管约10毫升，包扎，灭菌。

(4)对液体石蜡和涂杆等实验用玻璃器皿进行灭菌。

取样和培养

取2 ~ 3滴左右的水、湖水、废水，放入3个灭菌的乳糖胆盐液体培养基试管中，贴上标签(采样时间、人员、温度、采样地点、天气情况)，塞好棉条，放入恒温箱(37℃)中培养18 ~ 24小时；

观察气体产生和稀释

(1)观察产气管中是否有气柱，并标记阳性管的数量。

②样品稀释:

对5个灭菌试管进行编号(分别为1号、2号、3号、4号和5号)。从样品溶液试管中取出1毫升样品溶液，放入含9毫升生理盐水的试管中，作为1号试管。更换移液管，按照上述方法依次制备5份10倍系列稀释液。贴一个清晰的标签。

划线和涂层

(1)涂布平板法:

将融化的营养琼脂培养基倒入无菌平板中，制成无菌平板。冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴在平板表面，然后用无菌玻璃涂布棒将菌液均匀分散在平板的整个表面，置于培养箱中37℃培养24小时。培养后，选择单个菌落。

※涂层板法操作:

1.将涂抹器浸入装有酒精的烧杯中；

2.取少量菌液(不超过0.1毫升)，滴在培养基表面；

3.点燃火焰上沾有少量酒精的涂抹器，待酒精燃尽后冷却8 ~ 10s；

4.用涂布机将菌液均匀涂布在培养基表面。包衣时，旋转培养皿，使包衣均匀。

注意:

1.将涂抹器的末端浸入含有70%酒精的烧杯中。取出时，让多余的酒精完全滴在烧杯中，然后用少量酒精在火焰上点燃涂抹器。

2.操作时注意防火！不要将过热的涂抹器放在装有酒精的烧杯中，以免点燃其中的酒精。)

②号牌方法:

培养后挑出单个菌落，用无菌操作将少量菌落浸入接种环中，在无菌曙红亚甲蓝琼脂培养基平板表面连续划线。微生物细胞的数量会随着划线次数的增加而减少，并逐渐分散。如果裸奔合适，微生物可以一个个散开。37℃培养24小时后，在平板表面可获得单个菌落。(有时，这些单个菌落并不是全部由单个细胞繁殖，所以必须反复分离才能获得纯种。)

平板划线操作:

证明是确实的

观察EMB平板，菌落为紫黑色，有或稍有金属光泽，或浅紫红色，只有中心颜色较暗，选择符合上述特征的单个菌落进行革兰氏染色，显微镜检查(油镜)观察是否为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。

培养

A.将菌落转移到装有玻璃珠的无菌锥形瓶中，调节酸碱度至7，摇匀备用。

b、液体发酵:将1毫升处理后的样品溶液加入灭菌后的乳糖胆盐液体培养基中。摇匀后在37℃培养箱中培养24小时

文化保存

(1)斜面冷冻保存法:

这是最常用的方法。一般模具；放线菌和有孢子的细菌可保存2 ~ 4个月，酵母菌可保存2个月，无孢子的细菌每周移植一次。操作流程如下:

A.接种:将待保存的菌种接种到斜面培养基上，在试管上贴上标签，记下菌种名称和时间。

B.培养:根据所需的温度和时间培养各种细菌。

c、保存:选择生长旺盛的菌株，用卫生棉条将它们用无菌塑料包裹在试管上部，防止卫生棉条感染杂菌。储存在4℃的冰箱中。

(2)液体石蜡的储存方法:

这种方法可以用不能分解石蜡的细菌保存。保存时间为六个月至一年。放线菌；霉菌和产芽孢细菌可以保存两年。液体石蜡可以防止培养基中水的蒸发，导致细菌死亡。同时可以防止氧气进入，防止好氧菌的生长。从而延长菌种的保存时间。但需要注意的是，试管必须直立放置，不方便携带。操作流程如下

a .液体石蜡的灭菌:将液体石蜡放入锥形瓶中，其体积不得超过锥形瓶体积的1/3，用棉塞塞住，然后用高压蒸汽灭菌两次(120℃，30分钟)。然后在110-120℃烘箱中蒸发蒸汽灭菌带来的水分..此时石蜡透明清澈。检验后确定无菌。

b菌种培养:待所需菌种培养完毕后，选择健康菌种进行保存。

c .加入石蜡油:用无菌管吸取石蜡油，加入菌种试管，最好比菌种斜面顶点高1cm。较少，培养基会暴露在油表面，使培养基干燥，造成细菌死亡。

d采集:试管上部用塑料包裹，垂直立于4℃冰箱内。

e恢复:当使用菌株时。倒出石蜡油。这种石蜡油可以消毒和重复使用。接种培养。因为细菌外面有油。第一次细菌生长缓慢，性状恢复不是很好。所以需要再次移植才能获得好的品系。

总结

此外，实验结果的记录应包括:

1.观察并记录乳糖胆盐培养基的产气情况。

2.在EMB培养基上观察菌落(包括上述实验方案中规定的形状、质地和颜色。)

3.记录显微镜检查结果。

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