ngago 普渡大学团队：NgAgo有基因编辑能力！韩春雨事件核心争议技术迎最新研究进展

2019年4月4日，预印网站BioRxiv发表了美国普渡大学团队的一篇文章(无同行评议)。题为《NgAgo在大肠杆菌中增强的同源重组是由DNA 1内切核酸酶活性介导的》一文主要阐述了NgAgo内切核酸酶活性介导大肠杆菌同源重组的增强，即NgAgo具有内切DNA的能力(不同于从线性DNA分子两端切除)。

NgAgo是韩春雨论文欺诈的核心蛋白质因素。NgAgo能否用作真核生物中切割脱氧核糖核酸的脱氧核糖核酸导向内切酶，也是韩春雨论文造假中最关键的问题之一。

普渡大学论文(来源:BioRxiv)

NgAgo于2016年进入公众视野。当时以韩春雨为首的对NgAgo的研究，不仅在国内掀起了一轮“造星运动”，还引发了随之而来的强烈反弹关注和论文造假风波。2016年5月2日，河北科技大学的韩春雨作为通讯作者，在国际知名学术期刊《自然生物技术》上发表了一篇题为《利用北约细菌gregoryi Argonaute进行DNA引导基因组编辑》的研究论文。本文主要描述NgAgo的DNA引导基因组编辑并阐明其原理。这一发现被誉为继CRISPR-Cas9基因编辑技术之后的又一个“强大”的基因编辑工具。

图|河北科技大学副教授韩春雨

2016年7月29日，澳大利亚科学家盖坦·布尔吉奥发表了一篇长文，称韩春雨论文中的一些结果不能重复；国际转基因技术协会向其成员群发邮件，警告大家“NgAgo不能编辑哺乳动物细胞中的基因，不要浪费时间、金钱、人力和任务”。这一新的发展随后被国内多家媒体报道，而NgAgo争议也因学术界的国际化和特殊社会关注的普及而升温。

2016年8月2日，Nature Biotechnology首次就此争议表态。“许多研究人员已经联系了该杂志，称这项研究不能重复。本刊将按照既定流程对此事进行调查。”8月8日，《自然》杂志对此提出异议，并做了专题新闻报道，称要求不具名的科学家向《自然》记者证实了实验的可重复性。河北科技大学表示，一个月内，韩春雨将采取适当形式的公开核查，届时将有权威第三方作证。8月9日，在非营利组织Addgene的要求下，韩春雨发布了新版本的协议。直到2017年8月3日，自然生物技术发表了一份声明，撤回了韩春雨团队在2016年5月2日在该杂志上发表的论文。随着征兵的宣布，风暴结束了。

NgAgo的三维重建(在大肠杆菌中NgAgo增强的同源重建由DNA 1核内活性介导)

那么，普渡大学的最新研究能回答人们之前关于NgAgo的问题吗？

在了解NgAgo之前，让我们先了解一下pAgo。PAgo，即原核生物Argonautes，类似于成熟的CRISPR-Cas基因编辑系统，它还通过与导向单链核酸结合，切割其导向链识别的目标链，完成对目标DNA的编辑。

然而，与CRISPR-Cas基因编辑不同，pAgo不需要与靶基因相邻的原间隔基相邻基序(PAM)的额外短片段DNA。

理论上可以编辑任意序列的DNA，不受PAM的限制。由于其巨大的DNA编辑潜力，被研究者誉为基因编辑的“万能钥匙”。但由于深入研究和技术原因，帕果从未开发出像CRISPR-Cas那样简单实用的准商用产品。

NgAgo作为pAgo的候选，是近几年才逐渐被发现和纯化的，但之前的研究并没有让各国科学家意识到它具有DNA内切酶的功能。该分子来源于嗜盐古菌，一种古老的原核生物，细胞内表达量低，但在非嗜盐宿主中复性后没有DNA编辑功能。

之前的研究也证实了折叠的NgAgo在体外不能完成DNA编辑，但在37℃的细菌中可以具有基因组编辑功能。然而，普渡大学的这项研究表明，NgAgo确实具有DNA内切酶的功能。

图3 .大肠杆菌中NgAgo增强的同源重组由DNA 1核内活性介导

普渡大学的整个实验思路是:第一，净化NgAgo。在这一阶段，研究小组重建了NgAgo基因、GST和his标签作为载体，转化细菌，在22℃培养，由IPTG诱导，并发现表达的NgAgo表现出可溶性和包涵体的混合表达。纯化后的NgAgo分子分别用镍柱和谷胱甘肽琼脂糖柱层析纯化，得到可溶性和重折叠的产物。同时，根据氨基酸序列，用计算机进行分子三维重建。结果表明，NgAgo具有常规的N末端和PIWI、中间和PAZ结构域，还具有潜在的单链DNA结合结构域。

随后，在体外测试了纯化的NgAgo的活性和功能。他们发现非折叠结构的可溶性NgAgo分子在体外具有随机DNA切割功能。

ngago的repA和PIWI辅助结构域(在大肠杆菌中NgAgo增强的同源重组由DNA 1核内活性介导)如图所示

具体来说，这个分子的各个结构域有什么不同的功能？

研究人员首先利用repA敲除子和repA突变体分析了repA结构域的功能，发现repA主要负责识别和切割质粒DNA。随后，对PIWI结构域的功能测定表明，结果与repA相似，也具有切割DNA的作用。因此，负责实验的凯文·v·索罗门教授得出结论，NgAgo是一种核酸内切酶，依靠repA和PIWI实现其DNA消化功能。

因为哺乳动物体内有组蛋白，可以抑制pAgo的活性，所以研究人员选择在大肠杆菌中测试NgAgo的功能，结果表明NgAgo可以切割大肠杆菌中的DNA，同时更详细的研究表明，PIWI结构域对于靶向切割并没有那么重要，它可以随机切割一部分DNA，但是对于调控NgAgo的整体功能非常重要。另外，repA域主要负责定向剪切。在原核生物中，两个结构域，PIWI结构域和热重蛋白结构域，对NgAgo实现其核酸内切酶功能非常重要。

根据普渡大学的研究结果，NgAgo在体内和体外都可以实现其DNA内切酶功能。在体外实验中，可溶性和非重折叠的NgAgo可以切割目标DNA链。借助于两个功能域——日巴(repA)和PIWI()，NgAgo可以通过诱导其蛋白质中靶序列的双链断裂来增强大肠杆菌中基因的同源重组。

这些研究证实了NgAgo确实是一种DNA内切酶，也说明可溶性NgAgo可以切割靶区的DNA。在这个过程中，PIWI结构域的缺失会使目的基因难以识别，进而降低NgAgo的DNA剪切力。

刘东团队发现，NgAgo诱导的fabp11a基因敲除会导致斑马鱼的眼睛发育缺陷(来源:NgAgo的FABP 11 A基因敲除会导致斑马鱼的眼睛发育缺陷)

在普渡大学进行这项研究之前，国内关于NgAgo的研究进展有两个，也值得注意。

2016年11月，中国南通大学刘东团队的研究结果表明，NgAgo在gDNA的指导下可以与目的基因结合，同时抑制目的基因的转录过程，从而降低目的基因的表达水平。但该团队也否认NgAgo具有DNA消化功能但不具有DNA编辑功能。本文发表在2016年11月11日的《细胞研究》杂志上。

令人惊讶的是，2019年1月22日，中国学者张安定教授的研究团队公布了研究结果，称pAgo可以增强细菌同源序列的定向重组，并证实NgAgo系统通过其PIWI样结构域与重组酶A(recA)相互作用，从而增强了recA介导的DNA链重组。他们的研究揭示了一种增强同源序列指导的细菌基因编辑系统。这项研究发表在《核酸研究》杂志上。

显示了多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌中NgAgo基因的编辑系统(来源:原核精氨酸蛋白增强细菌中的同源序列定向重组)

以上研究均表明NgAgo具有可编程的DNA切割能力。但需要注意的是，作为基因编辑应用的有力工具，NgAgo在真核宿主中仍然存在一些挑战:离靶活性高、随机剪切率高、表达量低、潜在活性低。然而，进一步的研究可能会使用蛋白质工程来克服这些障碍，并开发NgAgo作为基因编辑的有力工具。

关于NgAgo科学家取得的最新进展，中国科学院遗传与发展研究所高级工程师江涛告诉DeepTech，这项工作仍处于非常初步的阶段，许多实验结果并不理想。

“比如大肠杆菌表达的NgAgo蛋白存在包涵体，包涵体复性不成功，所以可溶性部分不能排除折叠不正确的NgAgo。同时也没有NgAgo的纯度数据和证据，大肠杆菌本身就有很多活性很高的核酸内切酶，必须彻底清除。这种实验需要足够的阴性和阳性对照药物，我没有看到完整的实验证据。整个工作最有价值的部分是增加目标基因在大肠杆菌细胞中的重组率，这是旁证。遗憾的是，基因组编辑是否真实，并不是由后续的DNA测序结果直接证明的。NgAgo作为成熟的基因组编辑工具的基本条件是NgAgo能否在真核细胞中实现DNA内切酶。我个人认为，目前的结果很难通过严格的同行评审，所以我们必须改进和补充我上面提出的一些重要实验，”他说。

他透露，许多科学家都很清楚NgAgo的潜在优势——不受额外相邻序列(PAM)的限制，这意味着任何部分都可以编辑。我相信我国的韩春雨也注意到了，但他并没有真正重复他声称的基因组编辑，其他科学家也没有按照他提供的方法对NgAgo进行基因组编辑。普渡大学的成绩是一个初步的结果，甚至是粗糙的，还需要完善和补充。如果可行，需要建立稳定可靠的实验条件，给出基因组编辑成功率和脱靶率的数据。

需要指出的另一点是，不管其他人在NgAgo上取得了什么新进展，韩春雨都需要重复他发表的实验。

综上所述，经过之前的闹剧，一些学者还在努力开发NgAgo技术。普渡大学的最新成果再一次将NgAgo推向全球基因编辑研究者的眼睛，说明它有作为DNA编辑工具的潜力。虽然这种“利器”并没有在真核生物中发现其固有的DNA编辑能力，但这一研究结果足以让研究者兴奋。相信随着对NgAgo的不断了解和发展，我们希望能找到另一个强大的DNA编辑工具。

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参考:

保拉·潘多尔菲，弗雷德里克·金布尔，凯文·所罗门。在大肠杆菌中NgAgo增强的同源重组是由DNA 1核酸内切酶活性介导的