gith 【科学前沿】Science Immunology：狙击肿瘤，PD-1与GITR抗体联用竟有事半功倍之妙！

前言

近年来，靶向PD-1/PD-L1抗体的作用无疑极大地改变了我们对癌症治疗的整体方法和对宿主-肿瘤生物学的认识。由于癌症治疗过程中T细胞的功能障碍，大多数癌症患者在单独接受PD-1或PD-L1抗体后不能表现出持久的抗肿瘤反应。因此，抗体联合治疗的策略无疑成为免疫调节的替代方式，进而针对单独治疗PD-1或PD-L1抗体无效的肿瘤。

2018年11月，本月初，在《科学免疫学》杂志上发表的一篇题为《针对PD-1和GITR的联合癌症免疫疗法可以挽救CD8+t细胞功能障碍和维持记忆表型》的文章中，展示了联合使用抗PD-1抗体和抗gitr抗体促进淋巴细胞抗癌作用的机制。这种联合治疗可以显著改善CD8+ T细胞的效应子功能。它刺激效应记忆T细胞前体的产生，通过增强名为CD226的共刺激途径的活性，效应记忆T细胞前体可以快速增殖。本研究揭示了GITR抗体和PD-1抗体联合应用提高T淋巴细胞抗癌功能的分子机制，支持在临床试验中继续检验这种联合治疗的抗癌效果。下面的小系列会带你简单回顾一下这篇文章~

抗PD-1抗体和抗GITR抗体联合治疗

以协同方式抑制肿瘤生长

和肿瘤中CD8+ T细胞的功能障碍

首先，研究人员利用小鼠结肠癌模型评价了抗PD-1抗体、抗GITR抗体以及抗PD-1抗体和抗GITR抗体联合治疗的疗效，发现抗PD-1抗体和GITR抗体联合治疗可以显著提高荷瘤小鼠的生存期(图1A)，这种治疗主要依靠CD8+ T细胞作用于肿瘤(图1B)。同时，抗PD-1抗体和抗GITR抗体的联合作用可以增加肿瘤中效应T细胞/调节T细胞的比例(如图1C-D所示)，促进肿瘤中CD8+ T细胞的增殖(如图1E-G所示)。

图1。PD-1抗体和GITR抗体的组合能够协同抑制小鼠肿瘤，减少T细胞功能障碍

在肿瘤免疫治疗过程中，单细胞测序是一种非常重要的研究方法。单细胞RNA测序可以独立提供每个细胞的RNA表达谱，识别异质细胞群中的稀有细胞。肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)在抗体药物免疫治疗过程中会出现在肿瘤组织中，然后在肿瘤组织内部和周围形成复杂的肿瘤微环境，这是肿瘤免疫治疗的关键。然而，通过简单分析这些免疫细胞的表型很难获得免疫治疗的长期机制。因此，只有在单细胞水平上进行RNA研究，才能获得详细的肿瘤免疫图谱，为发现抗体药物靶点和潜在新肿瘤靶点的治疗机制提供数据支持。

通过先进的单细胞TCR测序技术，发现抗PD-1/GITR抗体联合免疫治疗后，

克隆和扩增的CD8+ T细胞群体具有独特的表型特征

为了更好的探索后续实验，研究者设计了一套单细胞TCR测序实验。首先，在第6天对荷瘤小鼠进行抗体药物治疗。治疗后第2天和第5天，取肿瘤细胞和脾脏，流式细胞仪分选CD8+ T细胞，流式细胞仪C1系统测序单细胞TCR(图2A)。如图2B所示，通过分析与t细胞功能障碍和活化相关的452个基因，热图被分为6组。p值受0.05的限制，p值越小，相应基因表达谱的差异越显著。数据显示抗PD-1抗体和抗GITR抗体的联合治疗主要在热图的第六组，也显示了不同抗体治疗的CD8+ T细胞的基因谱是不同的。

如图2C所示，进一步研究发现抗PD-1抗体、抗GITR抗体以及抗PD-1抗体和抗GITR抗体的组合能够上调作为t细胞活化标志的IL-12rb。与单抗药物治疗不同，抗PD-1抗体和抗GITR抗体的联合应用可以选择性抑制一系列与t细胞功能障碍相关的基因(Mt1、Mt2和Cd200等)的上调。)图2C中的红色、紫色和蓝色点分别代表在PD-1抗体与GITR抗体、PD-1抗体和GTIR抗体联合治疗期间特别上调的CD8+ T细胞群体的表型基因。在此过程中，CD8+ T细胞群体表现出不同表型基因的上调。水平和垂直坐标分别代表基因活性分数和功能障碍分数。横坐标越向右，与T细胞激活相关的基因上调越明显。图2D中的整合分析进一步表明，与单抗体处理和PD-1抗体与GITR抗体联合相比，联合处理对t细胞活化相关基因具有明显的上调作用。

图2。单细胞测序法绘制和分析CD8+ T细胞独特基因图谱

进一步的研究显示，抗PD-1抗体和抗GITR抗体的组合介导了独特的肿瘤特异性CD8+ T细胞群的形成

如图3A所示，用抗PD-1抗体、抗GITR抗体和两种抗体的组合处理的荷瘤小鼠，在处理后9天和12天，取出肿瘤t细胞并用相关标记物(PD-1、TIM3、LAG3、KLRG1、CD244和CD44)标记，并根据不同标记物的表达绘制肿瘤t细胞群。结果表明，经抗GITR抗体、抗PD-1抗体和GITR抗体联合处理后，抗原特异性CD8+ T细胞在不同分化阶段表现出异质性。整合并分析标记物异质细胞群的密度图，发现形成的14号、12号和7号细胞群对PD-1抗体和GITR抗体的联合治疗高度敏感，并揭示14号细胞群的出现预示着T细胞的功能障碍达到终点(14号细胞群在早期未形成)(图3B-G)

图3。联合抗体治疗后肿瘤浸润CD8+ T细胞群功能障碍的识别

虽然通过上述研究发现了肿瘤特异性CD8+ T细胞群，但不能解释PD-1抗体和GITR抗体联合治疗的长期效果。

为了找出抗体联合治疗长期有效的原因，研究人员随后对T细胞群体进行了表征和分析，并在T细胞激活和分化过程中使用了更多的标记物来标记T细胞进行深入分析(图4A-B)。SPADE聚类分析显示(图4C-E)，在抗GITR抗体驱动的免疫治疗12天后，肿瘤内出现了一个特殊的记忆细胞群，标志着获得性免疫的开启，维持了抗体联合免疫治疗的长期效果(图4F-G)。

图4。抗体联合治疗后记忆性CD8+ T细胞群的鉴定

到目前为止，我们了解到虽然PD-1抗体很少引起T细胞功能障碍，但不能维持免疫治疗的长期疗效。然而，在GITR抗体和PD-1抗体联合免疫治疗过程中，肿瘤中出现了记忆性CD8+ T细胞，这解释了以往研究人员对联合治疗长期疗效的困惑。

在抗PD-1/GITR联合治疗中，CD226在肿瘤特异性CD8+T细胞中广泛表达

为了进一步研究抗PD-1抗体和抗GITR联合治疗对CD8+T细胞群体协同作用的内在机制，科学家们开始深入研究上述CD226共刺激分子的表达。如图5A所示，在两种抗体联合治疗后，CD226 mRNA广泛存在于肿瘤中不同的CD8+ T细胞群中。此外，发现对抗原卵清蛋白(OVA)具有特异性的CD8+ T在用PD-1抗体处理的MC38小鼠的脾细胞中表达最高的CD226蛋白，这表明PD-1抗体的处理在抗肿瘤过程中对驱动表达CD226的抗原特异性T细胞起着关键作用(图5B)。

如上所述，PD-1抗体在治疗中起着如此关键的作用，那么PD-1信号通路与CD226又有什么关系呢？与CD28(共刺激受体)相比，CD226在LFA-1的存在下可以通过PD-1–shp 2进行剂量依赖性去磷酸化(图5C)。PD-1抗体治疗组结果显示CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中CD266高度磷酸化，而对照组无磷酸化，说明肿瘤PD-1/PD-L1通路对CD8+ T细胞中CD266的调节起负作用。上述数据表明CD266是PD-1–shp 2脱磷的另一个关键目标。(见图5D-E)

图5。CD226介导的抗PD-1和抗GITR抗体联合治疗小鼠MC38肿瘤模型的抗肿瘤效应研究

为了进一步验证CD266是抗PD-1和抗GITR抗体联合治疗介导的抗肿瘤的关键因素，研究人员将抗PD-1抗体和抗GITR抗体联合治疗应用于经CD266抑制剂治疗的荷瘤小鼠和被CD266基因敲除的荷瘤小鼠。结果，这种疗法没有发挥抗肿瘤活性，也没有提高小鼠的存活时间(图5G)。然而，阻断TNFR超家族信号通路和CD28分子并不影响两种抗体联合治疗的抗肿瘤效果。这为CD266在PD-1抗体和GITR抗体联合治疗中介导抗肿瘤作用提供了有力证据。

当然，所有好的科研成果都必须建立在大量实验研究的基础上。科学家随后使用RECNA(小鼠肾癌)模型进一步验证CD266分子在抗PD-1和抗GITR抗体联合治疗中的关键作用。实验数据表明，这与从以前的MC38小鼠模型中获得的结论高度一致(图6)。

图6。CD226介导的PD-1/GITR抗体联合治疗小鼠肾细胞癌模型的抗肿瘤效应研究

嗯，以上是这篇文章的简要回顾。

综上所述，PD-1抗体和GITR抗体虽然在各自的学校，但都是强结合的。在联合治疗过程中，不仅提高CD266的活化和表达，而且有效促进效应记忆细胞的增殖，维持长期抗肿瘤效果，进而发挥抗肿瘤作用。

这些令人眼花缭乱的数据和惊人的成果，都是基于科学的研究方法和强大的鼠标模型。

Baiosetu自主研发了双免疫检查点B-hPD-1/B-hGITR的人源化小鼠，在之前的研究工作中，分别验证了单免疫检查点B-hPD-1和B-hGITR的人源化小鼠的大量体内相关药效学(如图7和图8所示)。B-hPD-1/B-hGITR更适合人体PD-1抗体和GITR抗体药物(目前正在进行药效验证)的体内药效评价，文中提到的TILs在药效学方面的研究也是我公司特色的体外检测服务平台之一。如有需要，欢迎朋友前来咨询合作！