液相 实验室必备技能：高效液相色谱（HPLC）

高效液相色谱是一种色谱，它以液体为流动相，采用高压输注系统，将不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂和缓冲液泵入装有固定相的色谱柱，柱内组分分离后，进入检测器进行检测，从而实现样品的分析。该方法已成为化学、医药、工业、农学、商检、法律检验等领域的重要分离分析技术。

作为实验室最常见的精密仪器之一，它使用频繁，容易出现各种故障。因此，编制了高效液相色谱在使用中的日常维护方法，希望能为用户的日常使用提供一些参考。

流动相和样品的制备要求

1.高效液相色谱法酒精、二次蒸馏水和缓冲盐必须过滤，流动相需要定期更换。

2.流动相的脱气很重要(可以采用抽滤、超声波脱气等方法)；

3.样品溶解后，用0.22微米有机膜或水基膜过滤。

高压恒流泵的维护

1.高压恒流泵为整个色谱系统提供稳定平衡的流动相流速，确保系统的稳定运行和重现性。高压输液泵由步进电机和柱塞等组成。泵的内部结构在高压下长期运行后逐渐磨损。当流速增加时，梯度应该增加，优选每次增加0.2毫升/分钟，然后当压力稳定时，重复这一过程，直到达到所需的流速。

2.特殊情况下，可取下过滤头进行抽取，判断是否堵塞；流动相也可以用注射器吸出，通过过滤器吸头冲出，判断是否堵塞。堵塞时，可用异丙醇或甲醇超声清洗；如果清洗不成功，需要更换。

3.仪器用完后，及时清洗管道，冲洗泵，以保证泵的良好运行环境和泵的正常使用寿命。

色谱柱的维护

1.使用的流动相应为高效液相色谱级或同等级别。所有非高效液相色谱级试剂或溶液在制备过程中应使用0.22um滤膜过滤，流动相在使用前应使用超声波仪器脱气。

2.使用的水必须经过蒸馏和净化，然后用0.22um的水膜过滤。现在准备好所有测试溶液。此外，所有注射的样品必须用0.22um的薄膜注射器过滤。

3.使用的最大流量为1.0毫升/分钟，因此增加流量的过程应该是梯度的，没有流量的突然上升和下降。

4.仪器检测后，需要用流动相梯度洗脱色谱柱1小时以上。

工作站维护

如果崩溃，可以重新启动计算机；如果出现异常操作，首先更换电脑，测试其硬件故障；或者插拔接口，在本机上重新安装软件。

常见问题及解决方法

1柱压力问题

高效液相色谱在使用过程中应密切关注柱压问题。柱压的稳定性与色谱峰形、柱效、分离效果和保留时间密切相关。所谓柱压稳定，并不是指压力值稳定在一个恒定值，而是指压力波动范围在345kPa以内或50PSI之间(使用梯度洗脱时，允许柱压平稳缓慢变化)。高压和低压都是柱压问题。

高血压

这是高性能液相使用中最常见的问题，指压力突然增大。

1.一般是因为流路堵塞。此时，我们应该分段检查。

(1).首先断开true 空泵的入口。此时，聚醚醚酮管充满液体，使聚醚醚酮管低于溶剂瓶。检查液体是否自由滴落。如果液体没有滴下或滴得很慢，溶剂过滤头就会堵塞。处理方法:用30%硝酸浸泡半小时，然后用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴落，溶剂过滤头正常，正在检查中；

(2)打开吹扫阀，使流动相不通过色谱柱。如果压力没有明显下降，过滤白头堵塞。处理方法:取出过滤后的白头，用10%异丙醇超声处理半小时。如果压力降至100PSI以下，过滤白头正常，正在检查中；

(3)拆下色谱柱的出口端。如果压力不下降，色谱柱就会堵塞。处理方法:如果被缓冲盐堵塞，用95%的水冲洗至压力正常。如果堵塞是由一些强烈保留的物质引起的，应使用比当前流动相更强的流动相，直到压力正常。如果按上述方法冲洗压力长时间不下降，可以将色谱柱的进出口依次连接到仪器上，用流动相冲洗色谱柱。此时如果柱压仍不下降，只能更换柱入口处的筛板，但一旦操作不是很好，就容易造成柱效下降，尽量少用。如果问题无法解决，可以考虑更换色谱柱。

2.流速设置不正确:可以重置正确的流速。

3.流量配比不正确:不同配比的流动相粘度系数不同，粘度较高的流动相对应的系统压力也高。如果可能，可以更换粘度较低的溶剂或重置比例。

4.系统压力零点漂移:调整压力传感器的零点。

低血压

1.一般是因为系统泄漏。处理方法:查找所有接口，尤其是色谱柱两端的接口，将泄漏处拧紧。取出色谱柱，用适当的力拧紧或用四氟乙烯薄膜衬紧。

2.空气体泵入泵内，但此时压力往往不稳定，忽高忽低，更严重的是泵不能吸液体。处理方法:打开吹扫阀，以3~5ml/min的流速冲洗。如果无法做到这一点，请使用专用注射器通过外力吸出排气阀空处的气泡。

3.无流动相流出:检查储液瓶内是否有流动相，沉降片是否浸入流动相中，泵是否运转。

4.参考阀未关闭:降低流量后关闭参考阀。一般参考阀降至0.1 ~ 0.2 ml/min后关闭。

2个基线问题

基线漂移

基线漂移是色谱学家遇到的常见问题。在实际工作中，我们经常会遇到基线漂移，尤其是梯度洗脱。一般来说，机器刚启动时，基线容易漂移，需要30分钟左右才能平衡。如果使用缓冲液或缓冲盐，在低波长(220nm)下平衡时间会相对较长，但如果在实验过程中发现基线漂移，则应考虑以下原因:

1.随着柱温的波动，控制柱温和流动相的温度，并检查是否有打开的窗口或空是否对着柱温箱。

2.如果流动池被污染或有气体，用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流动池(最好断开色谱柱)。如有必要，使用1N硝酸(不是盐酸)。

3.紫外线灯能量不足。更换新的紫外线灯

4.流动相被污染、变质或用低质量溶剂制备。检查流动相的组成，使用优质化学试剂和高效液相色谱级溶剂。

基线噪声

对于紫外探测器，氘灯光源开启后预热30 min以上，基线才能稳定。噪声是指探测器输出信号的随机扰动，与被测对象无关。分为短期噪声和长期噪声。

如果氘灯使用时间过长，在接近其使用寿命时(氘灯的使用寿命约为1 000 h)会明显增加基线噪声，应及时更换氘灯。除了光源，流路中的气泡也会产生噪音。为了判断基线噪声的增加是由于光源灯老化还是由于流路中有气泡，关闭泵，继续走基线。如果噪声立即停止，基线在一条直线上，说明基线噪声来自于流动相中的气泡，要做排气。如果停泵后仍然有噪音，问题应被视为灯。

3保留时间

保留时间的漂移往往是由色谱柱老化引起的，不会引起保留时间的不规则波动。事实上，保留时间漂移的原因大多是由于不同机制的老化，如固定相的损失(如水解)、柱污染(由样品或流动相引起)等。保留时间漂移的一些最常见原因和解决方案如下:

列平衡

如果观察到保留时间漂移，首先考虑色谱柱是否平衡。

每次运行前，留出足够的时间来平衡色谱柱。通常需要10 ~ 20柱体积的流动相才能平衡，但如果在流动相中加入少量添加剂(如离子对试剂)，平衡柱需要相当长的时间。流动相污染也可能是原因之一。溶解在流动相中的少量污染物可能会在色谱柱上缓慢积累，导致保留时间漂移。需要注意的是，水是一种易被污染的流动相成分。

稳定相稳定性

固定相的稳定性有限，即使在推荐的pH范围内使用，固定相也会慢慢水解。

如硅胶基质在pH4时水解稳定性最好，水解速率与流动相和配体的类型有关。双功能配体和三功能配体的键合相比单功能配体更稳定。长链键合比短链键合更稳定。烷基键比氰基键稳定得多。

经常清洗色谱柱也会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相也可以在水溶液环境中水解，如等氨基键合。

色谱柱污染

保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。

高效液相色谱柱是一种非常有效的吸附过滤器，可以过滤和吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是:流动相本身、流动相容器、连接管、泵、注射器和仪器垫片、样品。

通常，污染源可以通过实验来判断。如果样品中有一种成分在色谱柱上有很强的保留，它可能是保留时间漂移的潜在来源。这些根通常是样品基质，如配药中的赋形剂、生化样品(如血清)中的蛋白质和脂类化合物、食品样品中的淀粉、环境水样中的腐殖酸等。

一般来说，样品中强保留组分的分子量较高。在这种情况下，当保留时间漂移时，背压将增加。样品预处理方法如固相萃取(SPE)可以用来消除样品基质的影响。避免色谱柱污染最简单的方法就是防患于未然。相比之下，发现问题和设计有效的清洁步骤来去除污染物要困难得多。

强溶剂通常在给定的色谱条件下使用，但不是所有的污染物都能溶解在流动相中。例如，THF可以在反相色谱柱中去除许多污染物，但蛋白质在THF不能溶解。二甲基亚砜常用于反相色谱柱中去除蛋白质。使用保护柱是一种非常有效的方法。反冲洗色谱柱只是最后的手段。

流动相的组成

流动相组成变化缓慢也是导致保留时间漂移的常见原因。如果流动相中的挥发性成分挥发并回收，应防止流动相因蒸发、反应等原因发生变化。

保留时间的再现是液相性能的重要标志。同样的事情，两次保留时间的差值不要超过15s。如果超过半分钟，可以认为是保留时间漂移，所以不能定性。

四峰异常问题

峰型是液相的主要问题。在制作液相的过程中，我们只需要改变不同的条件来改善坏峰类型。对于各种异常峰，要区别对待，从主要问题逐一解决。

色谱图中没有峰

系统未注入样品或样品被分解；泵未注入或流动相使用不当；检测器设置不正确；根据上述情况的原因，做出相应的调整。

一个或几个峰是负峰

流动相吸收背景高；进样时输入空气体；样品组分的吸收低于流动相。

所有峰都是负峰

信号电缆连接颠倒或探测器输出极性设置颠倒；光学尚未达到平衡。

所有的峰都是宽峰

系统不平衡；溶解样品的溶剂极性与流动的极性有很大不同。列大小和类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化的影响。

峰值比预期的小

样品粘度太大；进样失败或进样量错误；检测器设置不正确。循环音量不正确。泳池污染检测；检测灯有问题。

有双峰或双肩

注射量过大；样品浓度过高；堵塞保护柱或色谱柱的柱头；保护柱或色谱柱污染或失效；柱子塌陷或形成短通道。

向前延伸峰值

进样量或样品浓度高，溶解样品的溶剂比流动相极性大；保护色谱柱或色谱柱免受污染或失效。

①柱温低:提高柱温；

②样品溶剂选择不当:使用流动相作为样品溶剂；

③样品超载:降低样品含量；

④色谱柱损坏:更换色谱柱。

拖尾峰

过载色谱柱以减少样品量；增大柱径采用更大容量的固定相；峰干扰，清洗并过滤样品；调整流动相；在硅羟基作用下，加入三乙胺，通过碱钝化柱提高缓冲溶液或盐的浓度，降低流动相的pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；添加在线过滤器对样本进行过滤；死体积或柱外体积太大，无法最小化连接点；尽可能使用内径较小的连接管；柱效降低，换柱；采用保护柱，再生柱。

一个平坦的山峰出现了

检测器设置不正确；进样量过大或样品浓度过高。

鬼峰出现

进样阀的残留峰可能是最后一个样品的残留。每次进样后，用足够的时间平衡和清洁系统；样品中存在未知物质，提高了样品的预处理；如果流动相被污染，更换新的，尽量使用，过夜的流动相再次使用时过滤；尽可能使用高效液相色谱级试剂；流路中有小气泡。打开净化阀，增加流速以消除它们。

峰值分叉

①保护柱或分析柱污染:取下保护柱进行分析，必要时更换。如果分析柱堵塞，将其移除并清洗。如果问题依然存在，可能是色谱柱被强滞留物质污染，采取适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被堵塞。更换筛板或色谱柱。②样品溶剂不溶于流动相，改变样品溶剂。如果可能，使用流动相作为样品溶剂。

峰值变形

过载样品并减少样品负载。

早期峰值变形

样品溶剂选择不当①减少样品体积②使用低极性样品溶剂

早峰拖尾程度大于晚峰拖尾程度

柱外效应①调整系统连接(使用越来越短的内径管道)②使用小的流动池

酸性或碱性化合物的峰值拖尾

不合适的缓冲液①使用浓度为50 ~ 100 mm的缓冲液②使用Pka等于流动相pH值的缓冲液

额外的峰值

看上周