缩二脲试验不能发生在氨基酸中。与缩二脲试剂反应的其实是肽键,而氨基酸没有肽键。只有当两个以上的氨基酸相互缩合形成多肽时,才会形成肽键。氨基酸是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物。它们是通过用氨基取代羧酸碳原子上的氢原子而形成的化合物。
它是缩二脲试验肽和蛋白质所特有的颜色反应,而不是氨基酸所特有的颜色反应。一般来说,分子中含有两个氨基甲基酪基的化合物与碱性溶液反应生成紫色或蓝紫色的络合物。蛋白质分子中含有许多与缩二脲结构相似的肽键,在碱性溶液中能与铜离子进行缩二脲试验,颜色深浅与蛋白质含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成和分子量无关,因此可以用缩二脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲试验主要涉及肽键,所以受蛋白质特异性影响较小。而且所用试剂廉价易得,操作简单。可测范围为1-10 mg蛋白质,适用于精度要求不高的蛋白质含量的测量。能测到的蛋白质含量必须在0.5mg左右以上,双缩脲法的缺点是准确度低,样本量大。干扰该测定的物质包括缓冲液,其本质上是氨基酸或肽,例如TrIs缓冲液。因为它们产生阳性显色反应,铜离子容易被还原,有时会出现红色沉淀。
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