颅脑损伤患者急性期外周血miR-130a、miR-132的表达及其临床意义

路伟 李钢 周奋 刘仲海

[摘 要] 目的 探讨颅脑损伤（TBI）患者入院时外周血miR-130a和miR-132水平对病情严重程度的早期诊断价值，以及对重型颅脑损伤（sTBI）患者发病6个月预后的预测价值。方法 选择在我院救治的158例TBI患者和30例健康志愿者作为对照组纳入研究，根据格拉斯昏迷评分（GCS），将TBI患者分为轻度（mTBI）组、中度（msTBI）组和重度（sTBI）组。采用基因芯片技术筛选四组受试对象有表达差异的miRNAs，并筛选靶基因明确的miRNAs进行荧光定量PCR验证。随访6个月，根据格拉斯预后评分（GOS），将患者分为预后良好组和预后不良组。建立受试者工作特征（ROC）曲线确定外周血miRNAs对预后诊断的临界值。结果 经基因芯片分析选择miR-130a和miR-132作为目标miRNA，经荧光定量PCR检测，与对照组受试者相比，三组TBI患者外周血中miR-130a表达均显著上调，同时miR-132表达量显著下调（均P<0.05）。而且以sTBI组患者外周血miR-130a水平为最高，miR-132水平为最低。经Spearman相关性分析，TBI患者入院时GCS评分和外周血miR-130a表达呈负相关性（rs=-0.79，P<0.05），而和miR-132表达呈正相关性（rs=0.74，P<0.05）。根据6个月随访结果，39例患者预后良好，26例患者预后不良。预后良好组患者外周血miR-130a水平低于预后不良组患者（P<0.05），同时miR-132水平高于预后不良组患者（P<0.05）。经ROC曲线分析，入院时外周血miR-130a和miR-132水平对sTBI患者6个月预后预测的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.74（95%CI 0.57～0.87）、0.70（95%CI 0.63～0.85），差异无统计学意义（P>0.05）。而miR-130a和miR-132联合预测mTBI患者预后的ROC曲线AUC明显高于单项指标（P<0.05）。结论 TBI患者入院时外周血miR-130a和miR-132水平可早期评估疾病严重程度，并且可作为sTBI患者近6个月预后的早期预测指标。

[关键词] 重型颅脑损伤;基因芯片;微小RNA-130a;微小RNA-132;近期預后

中图分类号：R651.1+5  文献标识码：A  文章编号：1009-816X（2019）04-0299-05

[Abstract] Objective To explore the expression of serum miR-130a and miR-132 in patients with traumatic brain injury （TBI） and the predictive value on short-time （6 months） prognosis of patients with severe traumatic brain injury （sTBI）. Methods 158 TBI patients were divided into mTBI group， msTBI group and sTBI group according to Glasgow coma score，and 30 healthy volunteers were selected as control group. Using gene chip technology to filtrate different miRNAs in four groups ， then miRNAs with target gene were validated by fluorogenic quantitative PCR. According to Glasgow outcome score （GOS） after injury 6 months， TBI patients were divided into patients with good prognosis and patients with poor prognosis. Receiver operating characteristic （ROC） curve was built to analyze the predictive value of serum miRNAs at admission on short-time prognosis of patients. Results Choosing miR-130a and miR-132 as target miRNA through gene chip technology analysis. Validated by fluorogenic quantitative PCR， the expression of miR-130a in mTBI， msTBI， sTBI patients were increased gradually （P<0.05）， and the expression of miR-132in mTBI， msTBI， sTBI patients were declined gradually （P<0.05）. And the sTBI patients had highest level of miR-130a and lowest level of miR-132 than these of mTBI and msTBI patients （all P<0.05）. Spearman correlation analysis showed that the GCS score and miR-130a was negative related （rs=-0.79，P<0.05）， while GCS score and miR-132 was positive related （rs=0.74，P<0.05）. After followed up 6 months， there were 39 patients with good prognosis and 26 patients with poor prognosis. The level of miR-130a in good prognosis group was lower than that in poor prognosis group， the level of miR-132 in good prognosis group was higher than that in poor prognosis group （P<0.05）. The area under ROC curve of miR-130a and miR-132 at admission on prediction of prognosis of sTBI patients were 0.74 （95% CI： 0.57～0.87） and 0.70 （95% CI： 0.63～0.85）， which was lower than combined predictive value of miR-130a and miR-132 （P<0.05）. Conclusions Serum miR-130a and miR-132 at admission is closely related with the severity of disease， which could be the early sensitive predictors of prognosis in sTBI patients in 6 moths.

[Key words] Severe traumatic brain injury （sTBI）; Gene chip; MiR-130a;MiR-132; Short-time prognosis

重型颅脑损伤（severe traumatic brain injury，sTBI）是重症监护病房收治的最常见的危急重症之一，起病急，病情进展迅速、死亡率极高[1]。如何对患者病情严重程度以及预后迅速做出初步且准确的判断，并与患者家属沟通病情以及生存评估是神经外科医师最为棘手的问题。目前，电子计算机断层扫描以及磁共振成像可以帮助医师了解患者颅内脑组织损伤情况，但是尚不能完全准确地评估患者病情严重程度[2]。而颅内压、血压、血氧等指标具有一定的滞后性，易延误治疗时机[3]。因此寻找敏感度和特异度较高且操作便捷的检测对象，对于完善sTBI的病情监测、治疗选择以及预后评估具有重要的临床价值。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类长度约19～25个核苷酸的非编码小分子RNA，多数真核细胞中的miRNAs定位于基因间隔区，具有高度保守序列[4]。2008年，Mitchell等[5]学者发现外周血中也存在稳定表达的miRNAs，并且不受到核糖核酸酶降解的影响。在本项研究中，首先通过Agilent高通量基因芯片技术（miRbase V21.0）筛查sTBI患者外周血中的特异性miRNAs表达谱，以寻找可用于sTBI早期诊断和预后的潜在标志分子，同时也为sTBI发病机制的研究提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2016年9月至2018年1月期间由我院重症医学科和神经外科收治的TBI患者158例，男113例，女45例，年龄18～78岁，平均（57.38±13.45）岁。根据入院时格拉斯昏迷评分（glasgow coma score，GCS）[6]，13～15分为轻度TBI（mTBI组）共59例;9～12分为中度TBI（msTBI组）共34例;3～8分为重度TBI（sTBI组）共65例。其中，意外交通事故94例，高处下坠伤31例，重物砸伤25例，其他伤害8例。纳入标准：（1）年龄≥18岁;（2）损伤后24h内入院者;（3）入院后至少接受1次颅脑CT检查，并证实存在脑挫裂伤并伴发不同程度的颅内血肿和颅骨骨折者。排除标准：（1）创伤前存在颅脑病变者;（2）腹腔、胸腔、四肢等其他部位严重损伤导致低血压和低血氧等主要生命体征异常者;（3）合并高血压、糖尿病等慢性疾病者，急慢性感染者，肝肾等严重功能不全者以及其他严重系统性疾病者;（4）近3个月内有手术史、创伤史或者输血史者。该实验的所有过程均遵从赫尔辛基宣言标准，该研究方案经我院伦理委员会批准，且在充分告知可能存在的风险后与所有患者家属签署了知情同意书。另外选择同时期在我院健康体检中心进行体格检查且完全正常的健康志愿者30例作為对照组，男22例，女8例，年龄24～80岁，平均（58.96±14.37）岁。对照组和TBI组患者年龄和性别组成基本一致，差异无统计学意义（均P>0.05）。

1.2 方法：

1.2.1 血液样本采集：患者入院后立即采取外周静脉血3mL置于肝素钠真空采血管（美国BD公司），另外收集对照组体检时的血液样本，室温静置20min，1500r/min离心10min（离心半径8cm），取上清液，置于-80℃保存备用。

1.2.2 miRNAs芯片检测及分析：采用Agilent高通量基因芯片技术（miRbase V21.0，G4872A），检测样本来自于对照组、mTBI组、msTBI组和sTBI组各5例，四组受试对象的年龄、性别组成基本一致，差异无统计学意义（P>0.05）。按照TRIzol试剂盒（Invitrogen公司，美国）和mirPremiermicroRNA Isolation Kit（Invitrogen公司，美国）说明书提取外周血miRNA，并采用NanoDrop 1000检测miRNA的纯度。用标记酶Hy3TM荧光标记miRNAs，得到与芯片杂交的荧光探针。

1.2.3 荧光定量PCR：采用TRIzol试剂盒提取外周血总RNA，采用分光光度计检测RNA浓度。根据试剂盒说明书操作进行。根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。ΔCt=样品Ct均值-内参Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（随机阴性对照样品Ct均值-内参Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相对表达量。

1.2.4 sTBI患者的急救方法：sTBI患者接受院前急救和院内急救，在受伤现场或运送途中给予呼吸机维持呼吸、外周静脉补液、压迫止血和固定等措施。进入重症监护室后，有57例患者接受神经外科手术治疗，给予去骨瓣减压+血肿清除术或者微创血肿碎吸手术，脑室出血者进行微创脑室钻孔外引流;其余8例患者进行保守治疗。

1.2.5 sTBI患者的随访和预后评估：采用电话、家访或门诊复诊方式进行6个月随访，对所有患者进行格拉斯预后评分（glasgow outcome score，GOS）[8]，死亡为1分;植物生存为2分;重度病残，意识清楚但生活不能自理为3分;中度病残，生活能自理为4分;恢复良好，正常生活但有轻度神经障碍为5分。GOS≤3分为预后不良，>3分为预后良好。

1.3 统计学处理：将资料输入SPSS17.0版统计学软件进行处理分析，符合正态分布的计量资料以（x -±s）表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析;计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。建立受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线确定miRNA对sTBI的预后预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

本文还发现外周血miR-130a和miR-132水平与6个月预后有关。这主要与颅脑损伤过程中伴有的炎症反应有关。既往有学者通过细胞实验提出，miR-130a属于血管新生中靶向抑制血管新生转录因子、生长抑制特异性同源框蛋白GAX以及HOXA5蛋白的miRNA，与脑组织损伤后脑血肿的形成有关[13]。有学者通过动物实验证实，血清中miR-130a的表达量与脑血肿周围脑组织中miR-130a的表达量一致，是反映脑水肿程度的重要指标[14]。而miR-132分子已经被证实可以靶向抑制乙酰胆碱酯酶的表达和活性，从而增加乙酰胆碱的水平以及其抗炎作用。另外，miR-132在脑组织的发育、树突细胞的起源、突触形成和成熟中均发挥重要的促进作用[15]。因此血清中miR-132含量的高低也是反应TBI患者脑组织炎症反应的重要指标。基于上述机制分析，本文通过ROC曲线证实，入院时sTBI患者外周血miR-130a和miR-132水平对sTBI患者预后预测的ROC曲线下面积基本一致，差异无统计学意义，但是联合这两项指标的预测价值较高。

综上所述，入院时外周血miR-130a和miR-132水平检测有望成为早期评估TBI患者疾病严重程度，并及时预估近6个月预后的重要指标，对于现有的疾病监测和预后预测系统进行了一定的补充，有一定的临床价值。

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