免疫组化技术 技术篇——免疫组化＆病理诊断

免疫组织化学(IHC)是临床病理诊断中非常重要的技术和手段。自20世纪70年代以来，IHC被应用于病理诊断，对肿瘤的诊断、肿瘤的分类和预后的判断产生了巨大的影响。也拓展了人们对各种疾病和肿瘤形成过程的认识，提高了病理诊断和研究水平。然而，随着免疫组织化学的广泛应用，发现免疫组织化学技术存在一定的局限性。为了深入研究免疫组织化学的原理和技术，必须熟悉各种抗体的真实阳性反应部位，实现实验室间免疫组织化学的标准化，使免疫组织化学在病理诊断中发挥最大的辅助作用。

在病理诊断中，随着各种抗体新用途的发现和越来越多新抗体的出现，免疫组织化学对肿瘤的诊断和鉴别诊断、分类和预后判断产生了巨大的影响。免疫组织化学有一些局限性。因此，只有深入研究免疫组织化学的原理和技术，努力实现规范化操作，才能充分发挥免疫组织化学在病理诊断和鉴别诊断、判断预后和指导临床治疗中的作用。

1.免疫组织化学技术

观察组织切片中抗原的数量及其在组织中的分布，研究抗原的定位、定性和定量，称为免疫组织化学。因为抗原和抗体特异性结合，组织细胞中的抗原(多肽和蛋白质)可以通过制造显色剂(酶、荧光素、同位素、金属离子等)来确定。)通过免疫组织化学用抗体染色标记。在IHC使用的标本主要有两种:组织标本和细胞标本，其中石蜡切片是制作组织标本最常见和最基本的方法。石蜡切片可以很好的保存组织形态，有利于各种染色的观察，可以长期保存；石蜡切片中使用的甲醛固定剂对组织内抗原暴露有一定影响，但可以修复抗原，因此是免疫组织化学中制作组织标本的首选方法。

2.免疫组织化学在临床诊断中的作用

目前，免疫组织化学在临床上的应用主要包括以下几个方面

2.1良恶性肿瘤的判断

对于反应性增生或肿瘤性增生，免疫球蛋白(Ig)的单克隆或多克隆抗体可用于检测B淋巴细胞增殖。当卵泡反应性增生发生时，卵泡反应中心的细胞不表达凋亡蛋白(bcl-2)，但bcl-2为阴性。在滤泡性淋巴瘤中，90%以上的肿瘤滤泡细胞都有bcl-2的高表达，因此bcl-2呈阳性。然而，增殖细胞核抗原(PCNA)、循环和核抗原(Ki-67)可以评估肿瘤细胞的增殖程度，从而指示良性和恶性增殖细胞。

2.2确定肿瘤分期

肿瘤分期是判断预后的指标，与是否有浸润、淋巴管或血管浸润密切相关。免疫组织化学方法可以判断是否有浸润、淋巴管或血管浸润。层粘连蛋白和ⅳ型胶原单克隆抗体能清晰显示基底膜的主要成分，可用于区分原位癌和浸润性癌。上皮癌一旦作为浸润性癌突破基底膜，就是未突破基底膜的原位癌。血管和淋巴管内皮细胞的标记物，如因子8相关蛋白和D2-40，可以清楚地显示肿瘤侵入血管或淋巴管。因此，免疫组化结果是鉴别良恶性肿瘤以及是否有血管或淋巴浸润的主要依据。

2.3单元格属性的确定

特异性抗体用于标记细胞内相应的抗原成分，从而判断细胞的性质，确定肿瘤的来源。例如，细胞角蛋白(CK)是上皮标志物，CK阳性表示肿瘤是上皮肿瘤；降钙素抗体是甲状腺髓样癌的独特标志。甲状腺球蛋白(Tg)阳性表示滤泡性甲状腺癌。前列腺特异性抗原(PAS)仅见于前列腺上皮。阳性神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表明是神经胶质肿瘤。CD20和CD79a阳性表明是B细胞淋巴瘤。平滑肌肌动蛋白的阳性表达表明肿瘤来源于平滑肌。原癌基因蛋白产物CD117在胃肠道间质瘤中呈阳性。内皮细胞标志物CD34在血管肿瘤中呈阳性，等等。

2.4确定来源不明的转移性肿瘤的原发部位

对于来源不明的转移性肿瘤，免疫组织化学技术有助于确定恶性肿瘤的组织学来源，进一步确定原发部位。例如，角蛋白抗体(CK20)在胃肠癌、胆管癌和胰腺癌中呈阳性，而在肺癌、乳腺癌和肾癌中呈阴性。Tg阳性可考虑甲状腺转移；波形蛋白阳性支持肉瘤的诊断。前列腺特异性抗原(PAS)阳性可考虑前列腺转移。甲状腺球蛋白阳性时可考虑甲状腺滤泡细胞癌；当肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白和肌红蛋白阳性时，可考虑横纹肌肉瘤。S-100蛋白阳性支持黑色素瘤的诊断。这些都为肿瘤的治疗和预后提供了依据。

2.5“未分化”恶性肿瘤的分类

未分化的恶性肿瘤包括癌症或肉瘤。因为“未分化”的肿瘤，肿瘤细胞的来源无法分类。非特异性抗体用于初步区分组织学类型，然后选择特异性抗体进行进一步鉴定。比如低分化癌可以显示波形蛋白或S-100蛋白，有时淋巴瘤可以表达上皮细胞膜抗原，有些黑色素瘤可以显示角蛋白，这也强调了在肿瘤诊断中应该使用一组抗体而不是单个抗体。

2.6不同器官和组织交界处肿瘤的进一步分类

由于重叠的特征，很难仅根据组织学对一些组织和器官交界处的肿瘤进行分类。如胃肠梭形细胞肉瘤是肌源性平滑肌肉瘤，间质源性胃肠间质瘤(GIST)，或神经源性神经鞘瘤；同样发生在组织交界处的肿瘤是睾丸胚胎癌和精原细胞瘤，两者很难区分，治疗和预后有显著差异。而免疫组织化学更容易区分角蛋白:角蛋白阴性为精原细胞瘤，角蛋白阳性为胚胎癌。

2.7及时准确地检测微小转移瘤

难以用常规病理学方法检测的实体瘤转移被称为微转移。在常规组织切片中，很难区分单个或多个转移性肿瘤细胞，有时很难区分淋巴结中的窦组织细胞增生症和某些癌症的早期转移。免疫组织化学方法有助于及时准确地发现微小转移灶。对于乳腺癌来说，主要是腋窝淋巴结的检测，淋巴结微转移患者预后较差，对进一步治疗和预后判断有重要意义。

2.8与治疗和预后相关的免疫组织化学标记

与治疗和预后相关的标志物主要分为以下三类:(1)肿瘤基因标志物，如癌基因C-erbB2、c-myc、P53蛋白等。上皮性卵巢癌P53过表达与肿瘤扩散、分化及术后残留癌灶呈正相关；乳腺癌中表达C-erbB2的浸润性癌患者预后较差。肺癌中突变型P53基因蛋白表达增加，PTEN基因表达减少，提示肿瘤预后不良。(2)细胞增殖标志物:肿瘤细胞增殖是否活跃直接影响患者的临床治疗和预后，如表皮生长因子受体(EGFR)、Ki-67、PCNA、循环等。，可以评价肿瘤细胞的增殖情况。表达指数越高，增殖指数越活跃，恶性程度越高，预后越差，尤其是恶性淋巴瘤和乳腺癌；在乳腺癌的研究中，发现Ki-67和EGFR阳性患者的淋巴结转移率较高，与激素受体表达呈负相关。(3)类固醇激素受体:如雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)，广泛用于子宫内膜癌和乳腺癌。比如乳腺癌ER和PR的检测有助于确定临床治疗中是否需要内分泌激素阻断治疗，并能判断预后。ER、PR阳性表达，原癌基因(C-erbB-2)阴性表达的病例，对他莫昔芬等激素有反应。

2.9传染病诊断

用针对病毒、细菌、真菌和寄生虫抗原的特异性抗体进行免疫组织化学染色，可以检测和诊断多种感染性疾病的病原微生物，如乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、丙型肝炎病毒(HVC)、细小病毒B19、人禽流感病毒(AIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS)等。，因为免疫组织化学在感染性疾病的诊断中具有时效性、低风险性和高敏感性，(2)提供快速的形态学诊断，使严重的感染性疾病得到早期治疗；(3)当不能获得新鲜组织或没有培养方法时，提供诊断和研究，了解发病机理。

2.10药物靶标的免疫组织化学

免疫组织化学和分子病理学在疾病诊断中只起到辅助治疗的作用，而药物病理学则是利用病理学的方法来识别药物治疗靶点，评价药物治疗疗效，预测药物治疗反应。因此，药物靶向免疫组织化学属于“独立诊断”。因此，对控制和质量控制的设置提出了更高的要求。例如，对试剂的要求与一般诊断试剂不同，应根据药物管理的要求进行操作。3+染色的HER2蛋白可作为临床医生推荐患者接受曲妥珠单抗等药物的依据。

3.免疫组织化学的局限性

高灵敏度、准确性和特异性是理想的肿瘤标志物所必需的，但迄今为止发现的肿瘤标志物并不完全符合这些标准。一些正常细胞也分泌一些肿瘤标志物，所以肿瘤细胞学不产生单一标志物，即选择一组抗体比单一抗体更有利。评价免疫组织化学在肿瘤诊断中的局限性主要在于抗体特异性和解释。免疫组织化学操作中必须有适当的阳性和阴性对照。作为技术完整性的质量控制，当对照组被忽略或不理想时，免疫组织化学染色的结果应谨慎处理。免疫组织化学的正确结果不仅取决于技术步骤的标准化操作，还取决于正确的解释。当报告免疫组织化学染色结果时，不应单独解释。应考虑诊断和鉴别诊断、所用抗体的特性、所研究组织的性质，还应注意假阳性和假阴性结果的干扰。

3.1假阳性

假阳性结果是由于阳性信号定位不正确造成的，包括着色不均匀、背景着色、边缘效应等。此外，组织的某些特定成分也会导致假阳性结果。假阳性的可能原因是:(1)一级抗体的浓度和一级抗体是否无效，抗体有合适的浓度范围且必须在有效期内使用，过期抗体要么不显色，要么背景显色，形成假阳性；(2)试剂没有完全覆盖组织，组织边缘的试剂容易干燥，高于组织中部，造成深度染色；(3)抗体孵育时间过长，受室温影响，夏季较短，冬季较长。(4)手术过程中组织变干，导致组织边缘缩小或损伤形成伪影，产生假阳性；(5)3，3’-二氨基联苯胺(DAB)显色时间过长，目前应制备DAB，制备时间应在30分钟以内。(6)由于细胞质中蛋白质较多，间质和细胞质中有许多非特异性染色，如内源性酶血红蛋白和肌红蛋白引起的染色，可通过血清阻断解决；乳腺癌组织中的脂肪细胞和淋巴细胞也会产生非特异性染色；(7)非特异性抗体吸附常见于坏死组织，使坏死组织呈现高背景染色。在免疫组织化学中，应避免坏死组织较多的蜡块。

3.2假阴性

免疫组化结果假阴性是指所有抗体标记的切片均为阴性，无阳性信号，假阴性结果不是真反应。假阴性结果的原因有:(1)抗原修复方法选择不当，根据不同的抗原特性采用不同的修复方法。大多数抗体需要热修复，包括高压修复、微波修复、沸腾热修复；但有些细胞内抗原和间质抗原需要用酶消化，例如表皮生长因子(EGFR)需要胃蛋白酶消化，波形蛋白不需要修复。(2)一级抗体本身的问题:一级抗体滴度降低或失效。免疫组化假阴性染色结果会导致误诊或漏诊，影响临床诊断，延误治疗。为了解决这个问题，我们可以建立阳性对照，并比较它们之间的染色结果。如果表达阳性对照，说明试剂、染色体系、实验步骤没有问题；如果阳性对照不表达，说明检测过程中某试剂或某步骤有问题，应逐一查找原因。

4.免疫组织化学的质量控制

免疫组化染色切片的质量直接影响病理学家对其染色结果的判断，进而影响病理诊断。因此，做好免疫组织化学切片非常重要，这需要病理学家和病理学家之间的相互协调、密切合作和共同努力。病理学家选择抗体，设置质控品，解释结果并指导技术。技术人员进行实验操作，确保染色质量。制作免疫组化切片的过程有很多环节，每个环节的错误都可能影响最终的检测结果，如抗原保存、蛋白酶消化、增强技术、抗体管理、使用和试剂浓度等。所以制作高质量的免疫组化切片是多方面合作的结果。

为了保证免疫组织化学染色结果的可靠性，各实验室必须进行有效的质量控制，规范免疫组织化学的操作流程和步骤，并注意以下几点:(1)规范行为技术标准:如使用中性福尔马林(4%福尔马林加PBS)固定，并及时固定，切片烘烤时间过长，蜡泡温度过高等。温度过高，会破坏抗原决定簇，产生假阴性；(2)最佳试剂浓度:最佳试剂浓度的确定受固定方法、时间和组织处理过程的影响。最合适的稀释度是以获得最强的特异性染色和最弱的背景染色为标准；(3)为了保证免疫染色的质量，主要步骤是设置质控，包括阳性质控、阴性质控和空白色质控，必须同时设置，才能达到最佳的质控效果。对于抗原已知的阳性对照组，如含有抗原的正常组织，最好用含有少量抗原的肿瘤组织作为对照，使检测切片中的抗原水平趋于一致，后者可能含有表达抗原的非肿瘤组织，可作为内对照；阴性对照使用缺乏抗原的组织切片；空白色对照可用非免疫血清和缓冲液代替初级抗原。总之，只有阳性对照染色为阳性，阴性对照组织为阴性，所以免疫组化染色结果具有说服力；(4)抗原修复的一致性:抗原热修复的工具应使用微波炉或高压锅，修复温度和时间应尽可能一致，修复温度至少达到100℃，总修复时间不少于15分钟；修复液的PH值在7.0-8.0之间，如tris (ph 7-8)和EDTA (ph 8.0)修复液；(5)熟悉抗体的阳性定位:每一个抗体都有一个阳性定位。染色前，应确定抗体位于细胞质、细胞膜还是细胞核。比如ER、PR、P53、Ki-67位于细胞核内，如果细胞质或细胞膜阳性，也是假阳性；CD4、CD5、CD8、CD20、CD30、C-erbB-2等。位于细胞膜上，如果细胞质呈弥漫阳性或细胞核呈阳性，则为假阳性。其他抗体可以表现出两种阳性反应类型，如S-100，可以是细胞核阳性，也可以是细胞质阳性；癌胚抗原(CEA)定位于细胞质或包膜内。

在病理诊断中，随着各种抗体新用途的发现和越来越多新抗体的出现，免疫组织化学在病理诊断和治疗中发挥了重要作用，对肿瘤的诊断、鉴别诊断、分类等诸多方面都有很大影响。然而，免疫组织化学仍然存在一些缺陷和不足。作为病理学家和病理学家，不仅要充分认识到缺陷和不足，还要尽量避免因缺陷和不足而引起的误解。这就要求病理学家和病理学家在工作中不断学习研究，总结实际操作中的经验教训，分析失败的原因，努力做到操作的规范化、标准化，以充分发挥免疫组织化学在病理诊断、鉴别诊断和临床治疗中的指导作用。