核酸杂交带你更近一步了解PCR—

核酸杂交简史；

技术原理基础知识:

1、核酸的结构:

一级结构:核苷酸序列

稳定键:磷酸二酯键

二级结构:双螺旋结构

稳定键:氢键、碱基堆积力、疏水键

高级结构:染色体

一级结构和二级结构

高级结构

2.核酸变性:

变性:在某些物理化学因素的作用下，维持DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力被破坏，DNA由双螺旋变为单链。

化学键的变化:维持双螺旋断裂稳定性的氢键和疏水键，可以是部分或完全的，可逆的或不可逆的

化学结构变化:DNA变性改变了它的空内部结构，不涉及其一级结构的变化

3.核酸的复性:

是指变性DNA的两条互补链在适当条件下完全或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的反向过程。

4.退火:

一般热变性DNA缓冷后可以重折叠，这叫退火。双链DNA、RNA双链区、DNA、RNA杂交双链等异源双链核酸分子都具有这种性质。

5.核酸分子杂交

根据碱基互补原理将两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链结合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。

杂交的本质是在一定条件下对互补的核酸链进行复性

高级技术原理知识ⅰ

1.核酸探针的类型

核酸探针是指能够与特定核苷酸序列特异性互补杂交，并能在杂交后通过特殊方法检测的已知标记核酸分子。

2.选择探头的最基本原则

非常具体

探头的来源方便吗

探针准备困难

核酸探针的类型

脱氧核糖核酸探针

核糖核酸探针

寡核苷酸探针

3.探针长度

脱氧核糖核酸和核糖核酸探针

DNA探针通常有400~500个碱基。如果探针长度超过1500个碱基，杂交的背景会很高。DNA探针的长度可以在探针标记的过程中进行调整。DNA探针的长度可以通过改变间隙翻译中酶与底物的比例以及随机引物标记中引物与DNA模板的比例来调节。与DNA探针相比，RNA探针的长度不是那么容易控制的。在RNA探针标记过程中，RNA探针的长度实际上取决于将重组DNA分子线性化的限制性酶位点。

寡核苷酸探针

作为探针，它必须有足够的长度与目标序列特异性杂交。如果探针太短，它会与靶序列中的多个位点杂交，降低特异性。探针的最小长度取决于其目标序列的复杂性。哺乳动物基因组约为3×109bp，因此探针长度不应短于17个核苷酸。与基因组DNA相比，mRNA和c DNA的复杂度更低，因为它们是由基因组DNA序列不完全转录形成的，所以检测cDNA文库靶序列的探针可以更短。

4.核酸探针的标记

理想的探针标记应具有以下特征:

分析物应灵敏、特异、稳定且简单

标记物和探针结合后，杂交反应，特别是杂交特异性、稳定性和Tm值不应受到影响

该标记物对环境污染小，对人体无伤害，价格低廉

该标记不干扰检测方法

放射性同位素标记

Gap翻译法随机引物法

DNA探针的末端标记

单向体外转录制备RNA探针

非放射性同位素标记

酶标记的核酸探针

高碘酸钠法原理:由于HRP是一种与糖结合的酶，高碘酸钠可以将糖中的羟基氧化成醛基，然后与抗体连接，再加入硼氢化钠还原成稳定的酶偶联物。

生物素标记的核酸探针

5.标记探针的检测

放射性标记探针检测

放射自显影术——根据放射性核素释放的能量使相纸感光的原理

直接放射自显影术

在暗室中，将含有放射性杂化分子的胶片紧贴在x光胶片上，放入暗盒中。放射性核素衰减会释放出β射线照相胶片上的银粒子，产生稳定的潜像。胶片冲洗后，会产生一个可见的图像。图像的位置与杂化分子在胶片上的位置一致，图像的深度反映了杂化分子的含量。

间接放射自显影术

为了增加32P的检测灵敏度，X射线胶片被夹在增感屏和胶片之间。增感屏是一种覆盖有钨酸钙等闪烁体的弹性塑料片，受激发时会发光。32P的射线穿透X射线胶片照射到增感屏上，激发增感屏上的物质发光，其射线能使X射线胶片感光并产生潜像。

放射自显影摄影胶片的选择

所用放射性核素的辐射必须是可探测的

满足测试灵敏度和清晰度的要求

使用直接或间接放射自显影术

增感屏发出的光的波长

胶片显影方法

非放射性探针检测

非放射性探针检测示意图

酶促显色检测

直接检测:酶本身作为标记分子掺入核酸，洗脱后可直接检测。

酶直接作用于生色或化学发光底物，导致颜色沉淀或发光。显色沉淀可以用肉眼检测，而发光检测依赖于对蓝光敏感的x光片。常用的紫外和可见光光源有汞灯、氩氪激光和氦氖激光。荧光素发射的荧光波长的光源可用于荧光探针杂交的直接检测。

碱性磷酸酶显色体系:AKP可以作用于其底物BCIP去磷聚合，过程中释放H+还原NBT形成不溶性紫色化合物二甲基吡啶，从而使与标记探针杂交的靶位可见。

间接检测:检测地高辛、生物素或荧光素标记的探针时，需要加入一个将酶连接到杂交核酸分子的步骤。最简单的是同时加入链霉亲和素和HRP，使生物素化的杂交分子与酶形成连接，然后加入合适的底物。

荧光检测

荧光素是一种在激发光作用下能发出荧光的物质，包括异硫氰酸荧光素、羟基香豆素、罗丹明等。荧光素与核苷酸结合后可作为探针标记，主要用于原位杂交。

化学发光检测

化学发光:化学反应释放的能量以光的形式发射，一些底物被AKP水解会发光，从而形成检测信号。发射光的强度反映了酶的活性，进一步反映了杂化分子的数量。增强化学发光:辣根过氧化物酶将鲁米诺水解为3-氨基邻苯二甲酸酯，并在428nm处发出荧光。但这种情况下如果存在特殊化合物，发出的光强度会增加到1000倍，使得发出的光更容易被探测到，增强了反射的灵敏度。

多探针检测

使用多种探针，每种探针用不同的报告基团如生物素、荧光素和地高辛标记，同时与固定在膜上的核酸分子杂交，并通过使用不同的链霉亲和素或抗体-酶和相应底物的组合与不同的杂交分子显色。

高级技术原理知识ⅱ

1、核酸分子杂交的类型

分子杂交:样品核酸变性处理，在低温条件下，加入标记的核酸探针，探针与样品的互补序列形成杂交双链，通过展示标记或其他方法检测特定的核酸片段。根据杂交的反应条件，可分为固相杂交和液相杂交两种类型:

2.分子杂交技术的一般过程

探针的制备和标记

待测核酸样品的制备

杂交

杂交后处理

显示结果

结果分析