总结|离子交换层析概述

高纯度蛋白对实验的成功至关重要，也是结构和生物化学研究的主体。基于蛋白独特的理化性质，科学家利用层析法来分离和纯化蛋白。蛋白层析法是科学家可以掌握的最根本和最重要的技能之一。通过这篇文章，我们一起了解下离子交换层析。

离子交换层析简要概述

离子交换层析（IEX）基于特定pH下的净电荷差异分离生物分子。蛋白电荷取决于可电离氨基酸侧链基团的数量和类型。每个蛋白具有等电点（pI），即负电荷和正电荷的总数为零的pH。在低于蛋白pI的缓冲溶液中，蛋白带正电并将结合阳离子交换树脂的带负电荷的官能团。在高于蛋白pI的缓冲液中，蛋白是带负电荷的，并且将结合阴离子交换树脂的带正电荷的官能团。原则上，蛋白可以结合阳离子或阴离子交换树脂，但在实践中，蛋白质仅在窄pH范围内稳定，并且树脂的选择取决于蛋白质的pH稳定性。

离子交换层析树脂类型

离子交换层析树脂具有与树脂结合的官能团，其吸引相反电荷的生物分子。阳离子交换树脂带负电荷，阴离子交换树脂带正电荷。离子交换树脂也被归类为“弱”或“强”交换剂。这些术语与离子结合的强度无关，而是指官能团的电离状态随pH而变化的程度。 “弱”交换剂仅在有限的pH范围内电离，而“强”交换剂随着pH变化，离子交换容量显示没有变化。弱交换树脂可以随着缓冲液pH的变化而占据或失去质子，并且添加的电荷变化为结合和洗脱提供了额外的选择性尺寸。强交换剂不会变化，并且在宽的pH范围内保持完全充电。和使用弱离子交换剂相比，强离子交换剂更简单优化分离。下表总结了最常见的IEX树脂。

图1：离子交换层析树脂及其官能团

除了官能团之外，还需要考虑树脂的物理性质。树脂的尺寸，材料和孔隙决定了最大工作压力和流速（影响纯化速度）。更重要的是，树脂球的尺寸和孔隙率影响分离的分辨率。较大的树脂球通常有利于快速流速并提供适于早期和中期纯化的分辨率。较小的树脂球提供最佳分辨率，是后期纯化阶段的理想选择。

设计离子交换层析纯化方案的第一步可能是对您感兴趣的蛋白质的pI进行计算机测定。蛋白的pI由蛋白质链中每个氨基酸的总电荷决定。 Henderson-Hasselbach方程用于在某些pH下迭代计算蛋白质电荷，直到发现蛋白的净电荷为零的蛋白电荷。数学可以使蛋白质变得复杂，但幸运的是，有几种在线工具可用于估计蛋白的pI并指导您的实验：

一：ProtParam，由ExPASy主办。这是大多数生命科学家所知道的“经典”工具。可以根据蛋白序列计算理论分子量，等电点，消光系数等物理化学性质。该算法基于90年代初，Bjellqvist等人的工作。

二：计算点计算器（Isoeletric Point Calculator, IPC）。 IPC是一个“新学校”在线工具。它使用几种公布的算法和pK数据库来计算预测一系列pI。除了显示计算的等电点的范围之外，它还提供了所有方法的平均pI。与ProtParam确定的值相比，我发现IPC的输出更有用和更全面。

三：ProMoST网络工具。翻译后修饰（PTM）对蛋白的pI具有显着影响。大多数PTM发生在可电离侧链上，一些PTM如磷酸化或乙酰化引入新的可离子化的化学基团。如果您正在纯化可能进行翻译后修饰的真核生物蛋白，请使用ProMoST工具来计算和比较翻译后修饰对pI，分子质量和其他物理化学性质的影响。

记住，理论pI可能不同于真实的等电点，并且可能不反映蛋白表面上的实际电荷分布。电荷分布不均匀，并且一种蛋白在表面上既有正电荷，又有负电荷。当研究新的蛋白时，我总是筛选一系列阳离子和阴离子交换剂，弱和强，以优化纯化步骤。

缓冲系统，pH，添加剂和盐浓度的选择都直接影响IEX实验的成功。经常需要进行缓冲液检测以找到溶解度和吸附到IEX树脂的最佳pH。当筛选树脂和缓冲条件时，请注意以下几点：

一：将任何蛋白纯化或储存缓冲液的pH值保持在高于或低于其pI的0.5至1个pH单位以促进溶解度。蛋白的pI是没有净电荷的点， 蛋白可能在该pH下是不稳定的，较弱的反应性和最不溶的。

二：使用足以保持缓冲能力的缓冲液浓度，通常为25至100mM。

三：注意起始材料和洗涤缓冲液的离子强度，因为随着离子强度由于盐浓度而增加，蛋白对色谱柱的亲和力降低。如果您必须在较高的离子强度下使用缓冲液，那么现代的耐盐离子交换剂可以帮助克服这个问题。

四：如果将少量蛋白加载到IEX柱上，用起始缓冲液稀释蛋白溶液，这将有助于蛋白与柱子的结合。

五：色谱柱加载和洗脱过程中的流速下降会增加蛋白与交换树脂之间的相互作用时间，从而促进加载过程中特异性结合作用。

洗脱与选择性

通过增加缓冲溶液中的抗衡离子（盐）的浓度，蛋白通常从IEX柱洗脱。您也可以考虑使用pH位移。在使用弱离子交换树脂的情况下，或者调整盐浓度不能达到足够的分辨率时，它们可能有帮助。洗脱方法的选择，线性洗脱或阶梯洗脱都会影响选择性。此外，请记住下游技术，如表面等离子体共振。

当研究未知样本或峰值分辨率很重要时，使用线性梯度逐渐提高离子强度是理想的方法。峰值分辨率也可通过降低流速，以较大的体积洗脱，或用较窄的梯度洗脱来提高。步骤洗脱可以加速纯化时间，并减少最终的蛋白洗脱体积。一些洗脱策略使用梯度，如从高离子浓度的开始线性梯度洗脱。

通过选择使污染物结合最大化并允许靶蛋白通过柱的条件，使用差分柱色谱法（有时称为组洗脱或流通模式）去除污染物。这在以后的纯化步骤中特别有助于减少污染物和提高色谱柱的特异性。这是消除核酸污染物的普遍而非常有效的策略。 DNA和RNA在中性至碱性pH下具有很强的负电荷，因此它们紧密吸附到阴离子交换树脂，而不是阳离子交换剂。

离子交换层析是一种非常通用的蛋白纯化方法，对于某些分析（如SPR技术），这是非常重要的。该方法可以在任何纯化阶段使用，可用树脂的多样性可提供广泛的选择性，可以为您的目标蛋白进行微调。

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