【野尻】蛋白桑椹：1-脱氧野尻霉素的生物学特性和功能

1.2 1-脱氧野尻霉素的研究现状

1.2.1 DNJ的结构和来源

1.2.1.1 DNJ的结构

桑叶含有多种功能性成分，某些成分的含量与新鲜茶或某些蔬菜的含量相似或更高。桑叶的功能性成分包括大量矿物质、维生素、膳食纤维、氨基酸和黄酮，桑叶中还含有另一种生物碱33601-脱氧鸟苷(DNJ)，具有特殊的功能。DNJ是化学名称为3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为C6H13NO4，分子量为8 163的哌啶生物碱

[44-45]。

1.2.1.2 DNJ的来源

链霉素首先在Inoue等地用抗生素从链霉素中获得，DNJ被链霉素氢化。DNJ的来源有两大类：植物来源和微生物来源。植物来源为：桑叶(Morus Alba L .)。

赭草(学名Commelina communis)、风信子(学名Hyacinthus orientalis)、刺参属植物(学名Adenophora triphylla var.japonia)、爵床植物(学名adeno phora triphylla var.japonia)

(1)植物的DNJ

DNJ首先从M.Yagi等地从桑葚皮肤中分离出来，命名为“moranoline”，这是DNJ首次作为天然产物分离出来[46-47]。此后，Yoshiaki Yoshikuni也从三白皮中分离出了DNJ[48]。另外桑叶中也含有DNJ，桑叶DNJ的平均含量为0.11%

[49]

，桑椹的DNJ平均含量为0.14%。

雅托草是雅托果(commelianceae)植物，是中药中非传染性感冒的解热剂和治疗腹水、水肿、眼睑炎的主要成分，最近这种药草被用于治疗糖尿病。Hang Sub、Kim等首次在野草中DNJ、4公斤干燥的野草中含有DNJ 450毫克，其含量为0.01125%。

[50]。

风信子(风信子)是百合科植物。Asano等从风信子灯泡的甲醇提取物中分离为DNJ，7.6公斤新鲜风信子灯泡可获得160 mg DNJ，其含量为0.0012% [51]。

桔梗科(Campanulaceae)四参植物ADENOPHORA TRIPHYLLLA var . JAPONICA中有5种生物碱、Naoki Asano等从3公斤新鲜植物中分离出来，DN。

爵士乐床和植物Jacobinia suberecta的叶子上也检测到DNJ。

(2)微生物的DNJ

DNJ在燕姿灰色链霉素的部分菌株发酵液中也能检测到。Yohji Ezure等人首先从土壤中分离出产生DNJ的链菌，鉴定为软紫灰色链霉素SEN-158。他们从土壤中新分离的8，500株链霉素通过斜坡培养，-葡萄糖淀粉酶和-淀粉酶的鉴定，薄层分析法检测，筛选出96株含有DNJ的菌株。从土壤中分离出的淡紫色灰MB-733变异株淡紫色灰GC-148在发酵罐中发酵，可从培养滤液中分离DNJ。

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Formmer等在芽胞菌的培养滤液中也分离了DNJ。

1.2.2 DNJ的作用和用途

1.2.2.1 DNJ的降血糖作用

DNJ是所有哺乳动物、葡萄糖苷酶的有效抑制剂，可以减少碳水化合物消化和葡萄糖吸收，从而降低餐后高血糖。由于该特性，DNJ可用于糖尿病及糖尿病并发症、肥胖及相关功能障碍的治疗[55、56]。

DNJ对不同动物的a-葡萄糖酶有不同的抑制作用。DNJ抑制蔗糖酶和麦芽糖酶的IC50(DNJ达到50%时DNJ浓度)范围分别为6.6，1610 -8。

m和9

7.4，6310

-8

M.DNJ是对a-葡萄糖苷酶的竞争性抑制，经常在基质结合点或附近起作用，与底物竞争，与酶结合[58，59]。

DNJ的降血糖机制：食物中的糖类(如淀粉)在唾液1淀粉酶的作用下，在水解的同时进入胃内，到达胃内与唾液不混合的部分后，约70%仍在水解。大卫亚设，Northern Exposure(美国电视剧)，食物)然后进入十二指肠，在胰液-淀粉酶的作用下继续加水分解，制成甘蔗、麦芽糖等异糖。当异糖被运到小肠时，通过小肠上部存在的微纤毛膜表面存在的-糖苷酶分解成葡萄糖和果糖等丹，通过肠壁吸收到体内，血液中葡萄糖浓度急剧上升。当食物与DNJ一起摄取时，食物也到达小肠并分解为异糖，DNJ也进入小肠并与其中的-糖苷酶结合。由于DNJ和A-GLICOSIDA剂的亲和力大于ID和-GLICOSIDA剂的亲和力，DNJ阻碍了ID和-GLICOSID

糖苷酶不能分解异糖，异糖不会水解成葡萄糖，而是直接送到大肠。

。由于DNJ 的作用，进入血液的葡萄糖减少，因而血糖值降低了。

1.2.2.2DNJ对病毒活性的抑制作用

人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种逆转录酶病毒，它能引起T4

，

(CD4

，

)淋巴细胞病

变。HIV有两种糖基化的被膜蛋白:糖蛋白gpl20连接于CD4抗原上。糖蛋白gp41是一种横跨膜蛋白，锚定在病毒膜的被膜上。gp120和gp41与CD4

，

细胞结合并进行膜融合。这

些病毒被膜糖蛋白和寄主CD4表面受体在病毒穿透性、合胞体形成和病毒向邻近细胞扩散时起重要作用。因此，干扰病毒被膜糖蛋白发挥作用将是化学预防HIV感染的一种方法[60,61]。经DNJ对莫洛尼鼠白血病毒(MoLV)的抑制试验表明，DNJ具有显著的抗逆转录酶病毒活性，其IC50为1.2,2.5μg/mL，且随DNJ剂量的增加，其抑制力增强。糖蛋白形成过程中多糖前体转移到新生肽和以后的葡萄糖修饰等糖基化步骤对HIV被膜的加工、折叠是必要的。葡萄糖修饰是通过α-葡萄糖苷酶I和II切断外接α-1,2葡萄糖残基和内接α-1,3葡萄糖残基完成的，DNJ作为这些酶的抑制剂能够抑制葡萄糖的修饰，而改变HIV 在CD4培养细胞中的感染力。另外，由DNJ对葡萄糖苷酶I的抑制作用而致的未成熟糖蛋白的积累可能通过抑制细胞融合、病毒与寄主细胞受体结合、病毒穿透力和合胞体形成来抑制病毒的复制，从而抑制病毒活性[62]。

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1.2.2.3DNJ抑制肿瘤转移的作用

Tsutomu Tsuruoka等以小鼠B-16肺黑色细胞肿瘤为模型，研究了与野尻霉素相关的衍生物及其类似物的抗肿瘤转移活性，指出DNJ是野尻霉素的结构类似物，它对肿瘤转移的抑制率是80.5%，并阐明了抗肿瘤转移活性与抗糖苷酶和抗β-葡萄糖苷酶活性的可能的关系，认为DNJ对肺肿瘤转移的抑制机理可能是:DNJ通过抑制糖苷酶的活性在肿瘤细胞表面产生未成熟的碳水化合物链，削弱了肿瘤的转移能力。这些表面活性发生改变的肿瘤细胞被寄主免疫系统攻击而使这些肿瘤细胞不能结合到寄主细胞上[63]。但其详细的作用机理尚不清楚，有待于进一步研究。

1.2.3 DNJ的提取方法10

近年来,国内外对生物碱类成分的研究日趋深入,其提取工艺文献研究报道较多，主要有煎煮法、浸渍法、渗漉法、超声法和回流法等[64]。其中煎煮法受热时间长，温度高，生物碱易被破坏;浸渍法和渗漉法生产工艺长，溶媒用量大，提取液处理工艺繁琐，生物碱提取率低。但对桑枝的研究多见于药理方面，对其总生物碱提取分离及纯化工艺则几乎未见报道，长安大学李宇亮等人[65]研究了从桑叶中提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)的方法,探讨了提取剂、提取方法、料液比、提取次数、时间等因素对提取率的影响。

1.2.3.1大孔树脂吸附法

现在国内外学者多利用大孔吸附树脂来纯化生物碱。大孔吸附树脂是一类不含离子基团的网状结构高分子聚合物吸附剂，具有吸附性强、解吸附容易、机械强度好、可反复使用和流体阻力小等优点[66]。目前该技术在中药有效成分和有效部位的分离纯化，复方的提取精制，中药的化学成分分析，中药新药开发等方面的应用越来越受重视[67]。但是，大孔吸附树脂应用于中草药有效成分分离、纯化至今仍缺乏较系统地研究，工艺条件与参数不确切，对其整个工艺优化过程和建立内在质量控制指标的研究尚未见文献报道。

1.2.3.2高效逆流色谱技术

高效逆流色谱技术(High-speed counter-currenter-chromatography,HSCCC)是一种液-液分配分离技术，HSCCC分离效果好，溶剂用量少，应用范围广，不需要固体支持剂(载体)，不存在被分离组分的不可逆吸附，避免了样品的损耗和变性，其溶剂系统的选择可在较广泛的范围内进行。到目前为止，高速逆流色谱技术应用于研究氨基酸、嘌呤、吡啶、吲哚类植物激素、抗生素、酸、低肽混合物和中草药中的黄酮类、生物碱、蒽醌衍生物等各类活性成分的分离取得了较好的效果[68-70]。

1.2.3.3超声波萃取技术

超声波处理是属于利用外场辅助处理的一种技术，由超声波发生器发出的高频率振荡信号，通过换能器转换成高频机械振动而传播到溶剂中，也就是超声空化产生的强大剪切力能使植物细胞壁破裂，使细胞更容易释放内容物，而微扰效应促进溶剂进入提取物细胞，加速成分进入溶剂。可缩短萃取时间和提高萃取率并且还不破坏提取物的结构，超声萃取的选择性主要是通过溶剂的选择性来实现的，用超声萃取的方法提取生物碱、苷类、黄酮类、蒽醌类、天然香料和植物油等各类成分均有研究报道[71]。1.2.3.4超临界萃取法(Supercritical fluid extraction，SFE)

超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新型化工分离技术，被誉为21世纪的溶剂萃取技术。超临界流体是处于临界温度(tc)和临界压力(pc)以上的流体，兼有气体和液体的双重特点，既具有和气体相当的高扩散系数和低黏度，又具有和液体相近的密度, 对物质具有良好的溶解力，可被用作溶剂进行萃取分离。可作为超临界萃取的溶剂种类很多，例如CO2、丙烷、乙烷、乙烯、甲醇、水等

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[72]

。11

当然，除了以上一些方法外，还有絮凝澄清法、膜分离技术、半仿生提取法，而对于其中哪一种方法最适合桑叶中DNJ的提取，有待于检验。从文献资料分析，对DNJ的提取及分离纯化研究并不多，普遍存在提取率低，并且没有一整套的提取纯化工艺。期望从中摸索出最佳的提取工艺和能够大量处理总生物碱的分离方法以及简便、快捷、实用的纯化方法,从而为实现桑叶生物碱的工业化大生产及其质量控制奠定基础，并且以便于其在食品、医药等方面得到充分的发展。

1.2.4 DNJ的测定方法

目前报道的DNJ含量测定的方法，主要可分为两大类:离子色谱法和和高效液相色谱法。

1.2.4.1离子色谱法

离子色谱法是由Jeffrey Howard建立的，陈智毅等利用该方法分别对黄血蚕、蚕沙及蚕沙冲剂中的DNJ进行了定量分析。主要方法是，先将家蚕幼虫或蚕沙粉碎后经过超声处理1h，然后在60?水中抽提1h，12 000 r/min离心取上清液，之后进行离子色谱检测。检测结果得到黄血蚕中DNJ的含量是0.1890%，蚕沙中DNJ含量是0.1071%，蚕沙冲剂中DNJ含量是0.1099%

[73][74]

。

离子色谱法具有样品处理简单、易操作等优点，但分离效果和可靠性不够理想。而且该方法对于设备要求高，一般实验室不具备实验条件。在可供查阅的资料中也没有对该方法进行色谱分析方法认证的相关试验。

1.2.4.2高效液相色谱法

(1)高效液相色谱法-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)

姜永涛[75]，杨梅[76]等人曾分别用高效液相色谱法-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定桑叶中DNJ的含量。杨梅等人测定了不同产地桑叶样品中DNJ的含量，其中陕西桑叶为0.1764%，浙江桑叶为0.1932%，河北桑叶为0.1195%，重庆桑叶为0.1806%，河北蚕沙为0.0613%。姜永涛等人测定了山东桑叶和蚕沙中DNJ的含量，结果为:山东桑叶606 mg/kg,蚕沙241 mg/kg。

蒸发光散射检测器(ELSD)是一种新型通用的质量型检测器，其响应只与被测物质的质量成正比，而不依赖于物质的官能团和光学特性，理论上适用于挥发性低于流动相的任何组分的检测[77]。用ELSD作为高效液相色谱的检测器，具有快捷，灵敏，准确重现性好等优点。蒸发光散射检测器的适用面可能是目前所有的HPLC检测器中最广的，甚至有人称其为万能检测器，不过目前还在发展摸索的阶段，技术不是很成熟，价格也比较昂贵。

(2)柱前衍生化-高效液相色谱-荧光检测法

欧阳臻[78]、耿鹏[79]等人曾分别用柱前衍生化-高效液相色谱-荧光检测法测定DNJ。欧阳臻的试验中将桑叶经0.05 mol/L盐酸提取，在的硼酸盐缓冲溶液条件下，DNJ 与芴甲氧酰氯反应成荧光产物，然后用高效液相色谱-荧光检测器测定。试验测得桑叶中DNJ含量为0.24%。耿鹏的试验方法与欧阳臻所报道的类似，他测定了桑树不同部位DNJ含量的高低.