指南:
酵母双杂交技术是由Fields和Song于1989年提出的用于分析体内蛋白质相互作用的技术。目前，它仍然是鉴定和研究蛋白质相互作用的最好、最便宜、最省时和最直接的方法之一。这种技术可以很容易地用于识别给定蛋白质的相互作用蛋白质，检查两种已知蛋白质之间的相互作用，或者绘制相互作用结构域。该系列有五个基本方案，其中第一和第二方案可用于筛选新的潜在相互作用蛋白，第三和第四方案用于检测相互作用的特异性并消除假阳性，第五方案用于量化相互作用的强度(Aurora Paiano等人，2018)。今天主要介绍方案一。
酵母双杂交原理示意图
基本方案一
总结
在该方案中，通过文库筛选来鉴定与靶蛋白(诱饵)相互作用的蛋白。文库由一系列表达质粒组成，其中AD的编码DNA序列与各个cDNA融合。在连续转化中，用BD/诱饵质粒转化酵母菌株AH109，并将其包被在SD/-W琼脂平板(色氨酸缺乏培养基)上，选择转化的酵母细胞。将筛选出的转化酵母细胞进行培养，用AD/cDNA文库质粒(编码猎物蛋白)转化，置于SD/-WL琼脂平板上，同时筛选携带诱饵和猎物质粒的酵母细胞。为了选择可能在诱饵和猎物之间相互作用的克隆，在SD/-HWL(组氨酸、色氨酸和亮氨酸缺陷培养基)和SD/-AHWL(腺嘌呤、组氨酸、色氨酸和亮氨酸缺陷培养基)上培养酵母，并分别检测HIS3和ADE2报道基因的转录激活。
实验准备
步骤
诱饵质粒转化AH109的研究
载体DNA
用cDNA文库转化含诱饵质粒的细胞
摘要
酵母菌株AH109携带一个突变，可以抑制腺嘌呤合成途径，导致红色素积累，所以菌落会由粉红色变为红棕色。相反，如果表达ADE2基因，例如由于诱饵与猎物的强烈相互作用而打开腺嘌呤途径，那么红色素就会丢失或减少。所以如果表达ADE2，酵母菌落会根据表达水平由淡粉色变为白色。因此，菌落颜色可以用来指示ADE2基因的表达。筛选菌落时，虽然白色或浅粉色菌落表示ADE2表达，但也选择粉色菌落，因为这些菌落之间可能存在弱相互作用，不会激活ADE2表达。
请期待后续计划
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