引物设计 小白qPCR扫盲和2个超赞的在线引物设计网站介绍！

实时荧光定量聚合酶链反应引物设计

实时荧光定量聚合酶链反应是实验室中最常用的实验。研究基因的mRNA表达水平，验证基因敲除后下游靶基因的变化。

首先，实时荧光定量聚合酶链反应是一种用荧光化学物质在DNA扩增反应中测量每个聚合酶链反应循环后产物总量的方法。通过内部参考或外部参考对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

最常用的方法是SyBrGreenⅰⅰ和TaqMan探针法。下面介绍原理:

1.

SYBRGreenⅰⅰ方法:

在聚合酶链反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性掺杂到DNA双链中，然后发出荧光信号，而未掺杂到链中的SYBR染料分子不发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与聚合酶链反应产物的增加完全同步。

2.

TaqMan探测方法:

探针完成后，报道基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；在聚合酶链反应扩增过程中，Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性降解探针，并将报告荧光团与淬灭荧光团分离，使得荧光监测系统可以接收荧光信号。所以他每扩增一条DNA链，就形成一个荧光分子，荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步。

在设计实时荧光定量聚合酶链反应引物之前，每个人都应该知道引物设计中应该注意的一些细节和原则。

这里有两个在线设计实时荧光定量PCR引物的网站，不需要安装软件就可以直接在网上完成。

一个

黄金银行.

网站:https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

1.首先，进入网站主页，选择关键词，根据自己的需要选择物种和基因名称。

2.点击提交，出现如下界面。网站会推荐多对引物，可以根据引物长度和Tm值进行选择。

二

Primer3plus .

网站；http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

1.PUBMED获得基因序列后，在primer3plus主页上输入基因序列。

2.单击常规设置设置引物扩增长度。一般可以把扩增长度设置的大一些，然后根据推荐的引物选择合适的扩增长度。

3.点击选择引物后，您将首先看到一对首选引物和引物在序列中的位置。引物的Tm值和GC含量可以在Primer3plus网站上看到。

三

设计引物后，

最好在NCBI BLAST检查一下引物的特异性，然后交给公司合成。

1.进入pubmed主页，点击BLAST中的nuclear BLAST。

2.选择一个引物序列并将其输入对话框，然后单击BLAST。

3.网页打开后，会看到如下界面。不同的颜色代表引物序列的得分，一般会选择40分以上，也就是至少蓝色。继续下拉网页查看序列详情，物种分类，基因名称，序列位置。

“医疗方”一直致力于为“医务人员”服务，将最前沿、最有价值的临床和科研原创张文推给临床医生和研究人员

医学方面推出了“实验室里的那些东西”、“SCI写作技巧”、“文献精读与分析”、“医学英语轻松学习”、“国家自然科学基金应用”、“临床数据挖掘”、“基因数据挖掘”、“R语言教程”、“医学统计学”、“微创动物实验训练”等一批专题课程。如果需要了解课程的详细推文，可以关注“医学端”公众

腾讯课堂:https://medfun.ke.qq.com

网易云课堂:http://study.163.com/u/ykt1467466791112

客服电话:15821255568

客服微信:一学坊1234

温馨提示:医方还有专门的讨论组~明星导师都在组里，你可以回答你的问题。有兴趣可以加客服微信后加入群聊~