hazardous Journal of Hazardous Materials丨百迈客全长转录组成功案例第8篇

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2019年1月23日，《有害物质杂志》在线发表了中国科学院植物研究所研究团队何的研究论文《潜在用途是蜈蚣草砷超积累-植物修复调控网络》。本文通过三代全长转录组、两代转录组和蛋白质组的联合分析，阐述了蜈蚣草砷超积累的调控机制。

中文标题:蜈蚣草砷超积累调控机制在植物修复中的潜在应用

中文标题:蜈蚣草砷超积累调控网络在植物修复中的潜在用途

出版期刊:《危险材料杂志》

影响系数:6.434

砷是自然界中广泛存在的有毒金属元素。随着人类和科技的发展，农药和采矿对土壤造成了严重的砷污染。砷可以通过食物链从土壤富集到人体，对人体造成极大的危害。为了保护人类健康和维护粮食安全，迫切需要控制土壤中的砷污染。近年来，基于富含砷植物蜈蚣草的植物修复技术为砷污染土壤的修复提供了一种新的低成本、环境友好的处理策略。

蜈蚣草是砷超积累的模式作物，具有很强的抗砷和富集能力。据统计，蜈蚣草地上部分的砷富集量可达23 g/ kg，不影响其正常生长。蜈蚣草是一种有价值的植物修复材料。目前，蜈蚣草组学信息的缺乏已成为砷超富集机制研究的瓶颈，超富集过程中未知的关键分子元素极大地制约了植物修复技术的研究和发展。

研究材料和方法

材料:蜈蚣草的孢子体采自湖北武汉，在无砷培养土中生长至10厘米左右。

方法:以2 mM砷(ⅲ)(亚硫酸氢钠)或2 mM砷(ⅴ)(硫酸氢钠)为实验组进行水培处理。24小时后，收集根和茎部分进行测序。

水培处理后，收集根和茎部分进行测序。

测序平台:北京百迈科生物技术有限公司的Illumina和Pacbio测序平台..

研究结果

1.构建蜈蚣草“全长转录组-液泡膜蛋白质组”数据库

SR-uXRF扫描结果表明，蜈蚣草经砷(ⅲ)/砷(ⅴ)处理24h后，能迅速吸收和积累体内砷。本研究利用PacBio RS-II测序平台构建了3个1-2、2-3和3-6 Kb的文库，总长度为8个细胞，最大测序长度为50kb，平均长度为3，111bp。使用Illumina II测序平台共获得521个平均长度为924bp的双端阅读。通过蛋白质组测序分析，共获得13，595个液泡膜肽片段，可与转录组数据库中的1，512个转录本相匹配。与NGS测序技术相比，Pacbio可以获得更完整的转录本，转录本更少，但平均长度更长。用二代数据纠正三代数据后，成绩单质量从0.598提高到0.906。综上所述，经砷(ⅲ)/砷(ⅴ)处理后，共获得69，615个转录本、381个非限制性核酸内切酶、1，482个可变剪切和1，512个肽段匹配转录本。通过整合上述信息，构建了蜈蚣草全长转录组-液泡膜蛋白质组数据库。

图1。不同处理下蜈蚣草砷积累水平及“全长转录组-蛋白质组”数据库构建流程

2.砷(ⅲ)/砷(ⅴ)处理下蜈蚣草的基因表达谱

通过比较每两个不同组织的不同处理(CKS-砷(ⅲ)硫、CKRAs砷(ⅴ)硫、CKS-砷(ⅲ)硫和CKRAs(ⅴ)硫)，共获得4601个差异表达基因。K-means算法富集分析表明，6个聚类中的2，997个(65.1%) DEGs在根和地上部表达模式相反:k1、k3、k4和k6主要是地上部表达模式，其生物学功能包括光合作用等。而k2和k5主要在根部表达，参与ABC转运等功能。

WGCNA成分分析表明，粉色和紫色模块的地上部分与As(III)处理显著相关，而根模块中的绿色和紫色模块与As(III)处理显著相关，粉色模块与As(V)处理的地上部分显著相关，棕色模块与As(V)处理的根显著相关。根据KEGG富集分析，GSH代谢(ko00480)和ABC转运受体(ko02010)在所有经砷处理的样品中都得到了富集。内质网蛋白质加工(ko04141)主要集中在砷处理的根样品中。因此，这些途径可能在蜈蚣草砷过度富集中起重要作用。

图2。k-均值聚类和WGCNA成分分析

3.蜈蚣草主要转运蛋白家族的鉴定

在这项研究中，确定了已知的PvTIP41.PvACR3和pvacr 3；1，其中226个与砷胁迫有关。绝大多数砷相关转运受体与6个高表达基因家族有关，包括ACR3超家族、ABC超家族、MFS超家族、P型ATPase、NRT3超家族和MIP超家族。砷处理样品中ACR3超家族和ABC超家族基因表达水平上调，根砷处理组和地砷处理组MFS超家族基因表达水平上调，地砷处理组P型ATPase基因表达水平上调。根砷处理组NRT3超家族基因家族表达上调，根砷处理组MIP超家族基因家族表达下调..这些结果表明这些转运蛋白在砷转运中起重要作用。

通过使用全长转录物来构建蛋白质数据库，液泡膜蛋白被重新注释。总共发现了13，595个液泡膜蛋白肽，并比较了1，512个转录本。其中，鉴定出119个液泡膜转运蛋白，包括6个转运家族，包括P型ATPase、MIP、MFS、ABC、磷酸三糖和赖氨酸-苏氨酸转运受体8。其中，4种转运蛋白表达水平较高，与砷处理反应有关:大部分MIP和P型ATPase转运蛋白表达水平较高，而ABC和MFS转运蛋白在砷刺激后的地上部或根部表达上调。这些结果表明这些转运蛋白在砷在液泡膜上的过度富集中起重要作用。

图3。液泡膜中潜在砷转运体的鉴定及表达模式分析

4.蜈蚣草抗砷途径的鉴定

本研究表明，砷处理相关模块富集了错误折叠的蛋白质降解和谷胱甘肽代谢，为蜈蚣草的抗砷机制提供了新的思路。

在所有与砷处理相关的模块中，内质网蛋白加工途径(ERAD，ko04141)的富集程度最高。重金属可导致细胞内蛋白质错误折叠，引起内质网应激。内质网蛋白降解途径(ERAD)和泛素蛋白酶体途径(UPP)可以降解错误折叠蛋白的合成并维持细胞健康。砷处理后，所有与内质网应激相关的基因都没有被激活，但参与ERAD和UPP途径的基因表达上调，根中的基因表达水平高于地上部。根是环境中与砷直接接触的地方。错蛋白降解能力的提高可以保证根系的正常代谢，进而赋予其较强的抗砷能力。

谷胱甘肽代谢途径也在所有砷处理的样品中富集。在植物中，谷胱甘肽可以用作抗氧化剂来防止活性氧的破坏。在本研究中，谷胱甘肽合成的两个关键酶谷胱甘肽-1和谷胱甘肽-2不受砷处理的影响，但谷胱甘肽转移酶转录物的表达在砷处理后显著增加。谷胱甘肽硫转移酶可以通过谷胱甘肽和亚砷酸盐的结合介导砷硫醇化合物的形成。蜈蚣草具有很强的合成砷-谷胱甘肽复合物的能力，但其复合量很小，因此可能存在一个“砷(GSH)3络合-分配-降解”的高效过程。一旦砷(GSH)3进入液泡且GST不足，由于砷-硫醇化合物的高度不稳定性，可能发生不可逆的降解，导致砷(GSH)3含量低。然而，蜈蚣草高效的“砷络合-区室化”系统可以防止细胞质中的砷损伤，从而增加蜈蚣草对砷的抗性。

图4。ERAD途径与谷胱甘肽代谢过程

5.蜈蚣草砷超积累调控相关非编码RNA的鉴定及选择性剪接

在本研究中，共鉴定出1482个选择性剪接事件，分为六类:内含子保留、外显子跳跃和最终外显子可变切割。外显子1选择性剪接(AF)，3’选择性剪接位点(A3)和5’选择性剪接(A5)。Wgcna分析的结果分为四个模块(橙色、绿色、蓝色和灰色)。在地面上部，所有样本都与橙色模块相关，而在根部，绿色模块与As(III)R显著相关，蓝色模块与AS(V)R显著相关..不同模块的KEGG富集分析表明，绿色模块中内质网蛋白加工途径和谷胱甘肽代谢显著富集。通过聚合酶链反应鉴定相关可变切割。结果表明，可变切割极大地丰富了转录本的数量，并在错误折叠蛋白的降解过程和谷胱甘肽转移酶的表达中起调节作用。

图5。可变剪切的表达方式及功能分析

此外，本研究还鉴定了381个不同长度的lncRNA。通过WGCNA对lncRNAs和靶基因的共表达及相关性分析，发现lncrnas和来自AS(III)S处理组的靶基因主要与橙色模块相关，CKS主要与绿色模块相关，而来自根的ln crnas和靶基因与深灰色模块相关。“谷胱甘肽结合”条目在深灰色模块中富集，表明蜈蚣草根中的lncRNA可能参与了谷胱甘肽结合的调控。定量分析表明，根中与谷胱甘肽硫转移酶相关的基因表达水平呈正相关，表明该基因与其谷胱甘肽硫转移酶靶基因之间存在调控，以确保根中的砷抗性。

图6。lncRNAs的表达模式及功能分析

总结

第三代测序技术继续火爆，但如何利用该技术解决相应的科学问题，需要对技术路线设计进行深入思考和严谨研究。本文将三代转录组学技术与蛋白质组学相结合，不仅对表层数据进行罗列和总结，而且通过层层推进和深层数据挖掘，围绕研究重点(砷超富集机制)进行多角度论证，为阐明蜈蚣草砷超富集的调控机制奠定了重要基础，也为植物修复工程植物的培育提供了潜在的分子元素。

边肖消息

利用Nanopore或Pacbio三代测序平台对全长转录组进行测序，无需组装即可直接获得全长转录本，准确鉴定基因的选择性剪接、APA、融合基因、基因家族和非编码RNA。此外，全长转录组和蛋白质组的联合分析是近两年的研究热点。一方面，它可以建立蛋白质搜索数据库，全面准确地识别和定量蛋白质；另一方面，可变剪切事件是相互验证的。

自2015年以来，白玛克率先推出了PacBio的第三代测序平台。2018年8月，牛津纳米孔公司与白玛克公司达成长期合作，拥有MinION、GridION X5、PromethION三款完整的纳米孔测序仪。至今积累了丰富的项目经验，已成功发表8篇全长转录组文献，先后在《植物生物技术杂志》、《有害物质杂志》、《科学报告》和《鱼&贝类免疫学》等国际知名期刊上发表，是国内发表全长转录组最成功的案例的公司。发表的文章研究了杨树、蜈蚣草、甘薯、野生甘薯、兔子、跳蚤甲虫、红鱼和胡椒等物种，涵盖了森林、哺乳动物、昆虫、水产品和作物等领域。

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