sers 《自然·纳米技术》全息拉曼显微镜：3D活细胞追踪、防伪统统搞定！

1.表面增强拉曼光谱的挑战

由于克服了传统拉曼光谱中微弱信号的固有弱点，表面增强拉曼光谱迅速发展成为一种快速、可靠、超灵敏的检测方法，能够可靠、准确地识别各种复杂样品中的分子系统。然而，SERS面临着一个巨大的挑战，即纳米粒子作为光学平台的SERS效率低，导致获取时间长。

目前，最先进的拉曼光谱仪可以在100 ms内获得复杂等离子体纳米结构的光谱，虽然对于需要采集单一光谱的应用来说，这可能超过了足够的时间，但它完全限制了SERS在化学成像等领域的应用。与宽视场荧光显微镜不同，SERS成像仍然主要由扫描共焦显微镜进行。因此，与能够在几毫秒至几秒内采集快照图像的荧光显微镜相反，SERS成像需要逐点连续记录，导致采集时间增加到几个小时。事实上，该过程不仅限制了要绘制的区域并阻碍了3D断层图像，而且由于过度暴露于激发光而大大增加了对绘制表面的损害。因此，到目前为止，如何开发最小光毒性和快速成像方法已经成为SERS领域的一大挑战，并阻碍了SERS在活细胞亚细胞水平三维研究和防伪等技术领域的应用。

二、溶液-表面增强拉曼散射全息成像技术

为了缩短采集时间，一方面可以在工程上设计超亮SERS粒子，另一方面可以使用替代成像光谱仪更有效地采集数据。鉴于此，巴塞罗纳理工学院的Matz Liebel、Niek F.van赫尔斯特和弗吉尼亚大学龙蒿公立大学的Ramon A. Alvarez-Puebla将“SERS纳米粒子的工程设计”与“全息成像技术”相结合，提出了一种新的成像方法——全息拉曼显微镜。通过将迈克尔逊干涉仪与基于剪切干涉仪的全息显微镜耦合，研究人员同时记录了SERS纳米粒子的宽场图像的相位和振幅以及它们各自的拉曼光谱。此外，这项工作使数字图像传播不仅能够在3D中单个图像的不同Z位置定位多个SERS纳米粒子，而且能够在三维空间定位和跟踪活细胞中的单个SERS纳米粒子。相关研究成果发表在《自然纳米技术》杂志上，标题为“表面增强拉曼散射全息术”。

三，设计研究思路

为了实现低光毒性和快速成像的方法，研究人员从两点入手:“超亮SERS纳米粒子的工程设计”和“成像技术”:

1.在SERS粒子设计中，研究人员将小纳米粒子组装成等离子体纳米团簇，在有限的团簇尺寸内产生非常强的电场。这种超级聚类方法可以使探针小型化，从而提高空之间的分辨率，并减少对细胞存活的负面影响。具体来说，为了在尺寸、SERS截面和强度再现性方面制备合适的等离子体材料，研究人员合成了由各种SERS活性分子编码的高度均匀的16纳米金纳米粒子，然后将它们组装成大约100纳米的纳米粒子超簇。这些超团簇的特征是局部表面等离子体共振。与初始粒子相比，增强因子为2×106。这些具有不同SERS编码的明亮而强的纳米粒子团是快速多通道成像的理想系统，具有可再现性、易于制备、胶体稳定性和直接表面功能化的优点。

图1:自发拉曼全息成像的亮SERS超星系团。(a)分子和SERS基底之间的局部热点和强相互作用产生增强的拉曼信号；SERS编码的金超星系团粒子的透射电子显微镜图像；(c)由迈克尔逊干涉仪和剪切干涉仪组成的光谱分辨率全息宽视场显微镜示意图，可同时进行光谱分辨率成像和图像相位测量。

2.在成像技术方面，研究人员选择了数字全息成像技术，因为它不仅是体积成像的理想选择，而且可以在大的三维体积中从单个图像中跟踪数百个单个粒子。然而，全息技术严重依赖于相干光，因为它需要信号场和参考场之间的干涉来恢复重要的相位信息。所以对于自发拉曼散射，乍一看似乎不可能实现全息。然而，获得所需相位信息的一种方法是依靠自干涉，这可以通过剪切干涉方法获得，并且最近已经成功地应用于高达单分子极限的荧光发射体的3D成像。受此启发，研究人员组装了一台由迈克尔逊干涉仪和剪切干涉仪组成的光谱分辨全息宽视场显微镜，可以同时进行光谱分辨成像和图像相位测量。这也证实了自发拉曼信号全息成像的可能性。

4.基于SERS超星系团的初始活细胞跟踪

此外，研究人员还演示了一个初步的3D全息活细胞跟踪实验。首先，研究人员在37℃的HeLa活细胞中孵育掺SERS的超星系团3小时，然后获得延迟的SERS和亮场图像，以捕捉SERS粒子和细胞的运动。根据具有代表性的活体细胞10分钟SERS粒子跟踪视频，研究人员发现，连续采集亮场图像和SERS图像的时间间隔为500 ms，为了获得单个SERS探针的3D轨迹，研究人员依靠上述传播核进行基于拉曼全息术的3D单粒子定位。通过SERS信号的全息术测量的振幅和相位信息以50纳米的步长传播，并且在3 m的总Z范围内生成3D图像堆叠..一旦获得图像堆栈，结合高斯拟合和最大幅度估计就可以确定所有粒子的精确3D位置，然后将每个粒子的位置链接起来，生成图6所示的3D轨迹，显示了有限的3D扩散和有效的3D传输周期在活细胞中的结合。

图2:活细胞的SERS粒子追踪

V.摘要

总之，在这项工作中，研究人员实现了自发拉曼图像的全息测量，同时测量了所有单个SERS超星系团发射器的光谱含量。这些实验作为原理证明，实现了基于SERS超星系团的初始活细胞跟踪实验。证明观察到的发射确实是由于拉曼散射而不是背景发光或滤光器选择不佳。用于细胞内传感的最先进的拉曼传感器主要依赖于两个不同拉曼带的比率，并且可以通过光谱操纵由2D光栅产生的四个衍射级中的一些来实现这些带的同时测量。此外，这种策略可以允许同时对多达六个拉曼波段进行成像，从而实现更详细的多路复用布置，从而使得实时对生物系统执行复杂的化学定量成为可能。重要的是，即使多个实验允许直接进入高度复杂的现象，设计合理地依赖于系统的SERS探针也是重要的，以避免感兴趣的标记带被强但与实验无关的拉曼跃迁散粒噪声所掩盖。

目前，研究人员正在为活细胞中化学诱导的单拉曼全息术开发光谱复用技术，并将最终实现化学敏感细胞活动的精确3D绘图。希望这种作图功能能够促进细胞内代谢过程的详细化学文库的生成，使我们能够直接获得细胞内浓度平衡及其对细胞健康的依赖。这些观察不仅可以检测早期感染，还可以发现新的基于细胞的治疗方法来对抗复发性恶性肿瘤，如癌症。此外，超级簇和SERS全息术的结合提供的通用性和速度使得以复杂的3D模式生成复杂的图案和编码光谱信息成为可能，因此在防伪货币文件和商业标签领域具有很大的技术适用性。

参考文献:

论文连接:

声明:仅代表作者个人观点，作者水平有限。如有不科学之处，请在下面留言指正！