invitrogen官网 教程∣SiRNA设计从入门到精通，教会您如何筛选有效靶点！

RNAi(RNA干扰)是双链RNA高效特异诱导同源RNA降解的现象。使用siRNA进行基因沉默因其操作方便而受到研究者的欢迎，并且它也已经成为分子生物学应用中最常用的基因下调工具。

然而，设计siRNA的第一步是选择siRNA目标。你知道目标设计中所有的注意点吗，比如同源区域设计，blast比较？

今天，吉凯基因致力于SiRNA设计的教学，一步步教你设计siRNA！(如需视频连接，请联系我们。)

SiRNA的设计原则

1.选择目标序列

序列特点：19~21个碱基GC含量适中：35%-55%避免出现超过4个连续的A或T尽量设计在CDS区序列位置分布均匀

2.分析目标特异性

默认针对同源区设计与非目的基因连续匹配的碱基数不超过15bp

RNAi作用机制

SiRNA设计方法

1.美国国家生物技术信息中心

从NCBI获得关键信息:基因标识，基因库标识，转录本之间的同源性。

在NCBI主页的基因界面输入“基因名称”和“物种”，搜索相应的基因。

基因界面显示多种信息:

下拉到“基因组区域、反式和产物”，可以看到Genbank ID的转录物信息(共15个转录物)，对应于序列，可以在核酸界面查询。Genbank ID的命名规则如下:

NM,XM--编码类型转录本（NM为认证的，XM属于预测的）；NC,NG,AC等—基因组类型；NR,XR—非编码转录本（NR表示认证的，XR表示预测的）；AK、AF等命名—看注释，大部分为文章的作者提交的序列。

对应于基因库编号的水平线表示前体核糖核酸的垂直正方形表示外显子的轻正方形表示UTR

暗方块表示编码区域中每个基因库标识的公共方块是同源区域

选择转录较短、同源外显子数量最多的转录本作为设计靶，其位于同源区的概率较高(例如TP53基因NM_001276697和NM_001126115，它们只是外显子1序列在非同源区的一部分)。

2.Invitrogen RNAi设计师设计

打开Invitrogen网站，选择“siRNA”，在步骤1输入Genbank ID或核酸序列，在步骤2输入默认编码区；选择无爆炸；在步骤3中；步骤4 GC内容默认；Step5位数设计原理，默认可以使用。点击“RNAi设计”。

以设计NM_001276697为例，网站默认给出十个目标及对应信息。Rank星多的目标是高分，Tuschl的模式也是一种目标计分方法。答>:B& gt；C>。d的分数排名，这两项在选择目标时可以综合参考。

通用电气法界

GE Dharmacon是一家提供siRNA服务的专业公司，其设计网站具有一键同源区域设计功能，流程如下:

打开法界网站。第一步，有三种信息需要填写，即核酸序列(序列以fasta格式输入，以大于命名，序列填写在另一行)、基因号和基因库号。

步骤1:选择标识符类型

以TP53的基因ID为例，输入7157获得NCBI的转录本信息，同源区设计通过三个参数进行调整(截图部分):

“必需的”是指靶向对应的转录本(如果两者都是必需的，那么它是针对同源区域的)

“许可”是指相应的抄本可能是也可能不是目标

“排除”作为目标不针对相应的转录本(可以满足针对不同转录本设计特定目标的需要)

步骤2-4的参数与Invitrogen的参数相同，根据要求选择:

点击“设计siRNA”。从高到低打分，根据Access的Genbank ID在对应位置搜索序列(网站设计默认目标为19bp)。快速序列搜索见视频snapgene。

BLAST对齐

每个设计网站blast使用的底层数据库是不同的(NCBI数据总是更新的，不同时期存在不同的数据版本，网站blast数据库不一定实时更新)，导致不同的blast结果。因此，在设计中，我们放弃了网站本身的blast选项，直接将目标与NBCI-blast进行对比。打开BLAST网站:

填写核酸序列，选择比对数据库，点击“blast”。人和老鼠都有快速的选择。如果是其他物种，点击“其他”，默认为“nr/nt”，输入指定的物种。下面给出了三种说明:

挪威鼠(滑行编号:10116)

房屋鼠标(taxid:10090)

智人(taxi id:9606)

在结果界面，Max Score列值除以2表示匹配的碱基数；TP53基因的15个转录本全部完全匹配，所以目标位于同源区；其次，不完全靶的Max Score为30.2，即实际上与SIPA1L2结合了15个碱基，有4个错配，符合特异性原理，这个靶的blast结果还可以。

以上是目标设计和对比的过程。这种方法也适用于非编码RNA。选择多个网站设计的共同目标，设计2~3个目标进行验证，更有利于筛选有效目标。你学过今天的目标设计吗？！

SiRNA设计和使用的网站和网址(可点击链接)

NCBI基因查询

NCBI核酸序列查询

Invitrogen网站

通用电气法界

NCBI爆炸

Snapgene软件下载

陈建儒，吉凯基因工具病毒产品售前技术专家；从事载体构建5年以上，熟悉各种核酸数据库及核酸相关分子设计和预测；我在基因操作软件和网站上录制了很多课程，被用户一致评价为“极其实用易学”！

接下来，陈先生接下来的课程将与您见面。如果对课程感兴趣，想进一步交流，请加个微信号(13162396225)得到陈老师的1V1指导~ ~

1.怎么找到基因序列？

2.怎么设计引物？

3.RNAi/CRISPR靶怎么设计？

4.如何预测miRNA靶基因/miRNA结合位点？

5.如何预测转录激活因子的结合位点？

非编码RNA是国家自然科学基金的研究热点，吉凯基因将于6月27日(周四)15:30直播，这次千万不要错过！

非编码RNA:国家自然科学基金的研究热点

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