pcr技术的原理 一文读懂分子诊断技术、PCR技术、基因测序技术的区别、原理以及发展历程！

分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，利用分子生物学技术检测基因的存在、缺陷或异常表达，从而诊断人体状态和疾病的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否发生变化，DNA或RNA的数量以及表达功能是否异常，从而确定受试者是否在基因水平上发生异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。一般来说，所有基于分子生物学水平的方法论技术都是分子诊断技术，如PCR技术、基因测序技术等。

聚合酶链反应技术，即聚合酶链反应，是一种扩增特定DNA片段的分子生物学技术。其基本原理类似于DNA的自然复制过程，由模板DNA变性、模板DNA和引物退火(复性)、引物延伸三个基本反应步骤组成。通过重复循环变性、退火和延伸三个过程，可以获得更多的“半保守复制链”，这个新链可以成为下一个循环的模板。每个周期需要2 ~ 4分钟完成，2 ~ 3小时即可扩增出数百万倍的待扩增目的基因。这个想法最初是由穆利斯在1983年提出的。1985年，他发明了聚合酶链式反应，即简单的DNA扩增方法，这意味着PCR技术的真正诞生。简单来说，PCR技术本质上是以扩增DNA片段为目的，通过实时荧光PCR技术可以检测样品中DNA的含量。

基因测序技术是确定DNA序列的技术。在分子生物学的研究中，DNA序列分析是进一步研究和转化靶基因的基础。目前用于测序的技术主要有桑格等人(1977)发明的双脱氧链终止法和无极生组合和吉尔伯特(1977)发明的化学降解法。这两种方法原理上差别很大，但都是从一个固定点开始，随机在一个特定的碱基结束，产生A、T、C、G四组不同长度的核苷酸，然后在尿素变性PAGE凝胶上电泳检测，从而得到DNA序列。桑格测序法目前已被广泛应用。简单来说，基因测序技术的目的是对DNA片段进行测序和分析，从而使DNA序列清晰。

让我们来看看过去50年来分子诊断技术的发展:

基于分子杂交的分子诊断技术

从20世纪60年代到80年代，分子杂交技术在过去的20年中发展最快。由于无法人工扩增样本中的目标基因，人们只能通过已知基因序列的探针来捕获和检测目标序列。其中，液相和固相杂交的基础理论、探针固定和包被技术以及cDNA探针合成为基于分子杂交的体外诊断方法提供了初步的技术储备。

蛋白质印迹技术(Southern印迹)

southern[1]1975年发明DNA印迹技术，用限制性内切酶将DNA片段化，用凝胶电泳分离出不同长度的DNA片段，用虹吸或电压转移的方法转移到醋酸纤维素膜上，将膜上的DNA变性后与核素标记的寡核苷酸探针杂交，洗脱后用放射自显影法鉴定DNA片段与探针之间的同源序列。该方法同时具有DNA片段消化和分子探针杂交的优点，保证了检测的特异性。因此，它已成为探针杂交领域最经典的分子检测方法，广泛用于鉴定各种基因突变，如缺失、插入、易位和限制性片段长度多态性(RFLP)。1977年Alwine等人【2】引入的基于转移杂交的Northern印迹技术也成为当时RNA检测的金标准。

(2) ASO反向点杂交(aso-RDB)

利用蛋白质印迹技术对核酸序列进行杂交检测具有较高的特异性，但存在操作复杂、检测时间长的缺点。1980年建立的斑点固定技术摆脱了传统的DNA印迹需要通过凝胶分离技术固定样品的缺点。第一个等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)是通过在质粒载体中引入单碱基突变而构建的，这使得检测核酸序列的点突变成为可能。1986年，斋祀[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性相结合，实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。后来，为了完成同一样品中多种分子标记的高通量检测，斋祀[4]发明了ASO-RDB，将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定在膜上的探针杂交显色，进行基因分型和基因突变检测。这种方法可以将多种寡核苷酸探针固定在同一条膜条上，仅通过一次杂交反应就可以筛选出待测样品DNA的几十个甚至几百个等位基因。它具有操作简单、快速的特点，一度成为基因突变检测、基因分型和病原体筛选最常用的技术。

(3)荧光原位杂交(fish)

荧光原位杂交起源于核素标记的原位杂交技术。Rudkin[5]在1977年首次完成了荧光素标记探针原位杂交的尝试。上世纪80年代，细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向了临床诊断的实际应用。与其他只检测核酸序列的分子诊断技术相比，FISH结合了探针的高特异性和组织学定位的优点，可以检测和定位完整细胞或分离染色体中特定的正常或异常DNA序列；由于使用高能荧光素标记的DNA探针，可以使用多个荧光素标记同时检测几个目标。

如今，FISH已广泛应用于核型分析、基因扩增、基因重排、病原微生物鉴定等领域。比较基因组杂交(CGH)和光谱核型分析(SKY)等FISH衍生技术在越来越多的临床诊断领域发挥着重要作用。

(4)多重连接依赖探针扩增(MLPA)

斯豪滕等人于2002年首次报道了MLPA技术。每个MLPA探针由两个荧光标记的寡核苷酸片段组成，一个由化学合成，另一个由M13噬菌体衍生法制备。每个探针包括一个引物序列和一个特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段与靶序列杂交，然后两个探针通过连接酶连接。连接反应是高度特异性的。只有当两个探针与靶序列完全杂交时，连接酶才能将两个探针连接成完整的核酸单链；相反，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基差异，也会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对荧光标记的通用引物对连接的探针进行扩增，每个探针扩增产物的长度是唯一的。最后，可以通过毛细管电泳分离扩增产物来检测核酸序列。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理，MLPA技术最多可以在一个反应中鉴定出45个靶序列的拷贝数。

该技术具有探针连接反应的特异性和多种扩增探针杂交的高通量特性。经过10多年的发展，MLPA技术已经成为涵盖各种遗传病诊断、药物遗传学中多个基因位点的鉴定、肿瘤相关基因突变谱的筛选、DNA甲基化程度的量化等的综合分子诊断系统。MLPA技术是目前临床上最常用的已知序列变异和基因拷贝数变异的高通量检测方法。

(5)生物芯片

1991年，Affymetrix公司的Fordor[[7]利用Fordor开发的光刻技术制备了第一个以载玻片为载体的微阵列，标志着生物芯片成为一种实用的分子生物学技术。到目前为止，芯片技术已经取得了很大的进步。如果按其结构分类，基本上可以分为两种:基于微阵列的杂交芯片和基于微流控的反应芯片。

1.微阵列芯片

(1)固相芯片:基于微阵列的基因组DNA图谱(MGDP)芯片:微阵列技术应用于MGDP检测已有十多年，其技术平台主要分为两类，即基于阵列的比较基因组杂交(ACGH)和SNP阵列。顾名思义，aCGH芯片利用待测DNA和参考DNA之间的双色比较来显示它们之间拷贝数变异(CNV)的变化，而单核苷酸多态性(SNP)芯片不需要与参考DNA进行比较，直接通过杂交信号强度来显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的发展，市场上出现了能够同时检测SNP和CNV的高分辨率杂交基因阵列芯片。MGDP芯片主要用于发育迟缓和先天性畸形等儿童遗传病的辅助诊断和产前筛查。经证实，利用MGDP芯片检测染色体不平衡与荧光原位杂交诊断的符合率可达100%[8]。基因表达谱阵列(GEP阵列):1999年，杜根等人[9]首次使用基因芯片来绘制基因表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的重要性日益增加，出现了microRNA芯片和长非编码RNA(RNA)芯片。与MGDP芯片类似，GEP芯片利用反转录后产生的cDNA文库与固定在芯片载体上的核酸探针杂交，从而检测杂交荧光信号的强度，判断基因表达。与基因组杂交相比，GEP芯片可以检测到在生物学上更为重要的转录组信息，这对疾病的诊断和预后具有特殊的意义。目前，GEP芯片已用于急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征等血液疾病和神经退行性变的诊断、分类和预后评估，并取得了令人满意的结果

(2)液相芯片:传统的固相芯片将检测探针锚定在固相载体上，以捕获目标序列，而Luminex公司的xMAP技术[10]通过两种红色荧光染料不同比例的匹配来标记不同荧光颜色的聚苯乙烯微球，并对其进行编码，得到数百个荧光数字的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联到编码的微球上，从而可以通过微球编码来区分不同的探针。用混合探针-微球复合物与待测样品杂交，使微球通过由流动鞘液驱动的红绿双色流式细胞仪，其中红色激光检测微球编码，绿色荧光检测杂交核酸探针上荧光报告基团的信号强度，从而一次同时鉴定单个样品中的多种靶序列。目前，该技术已广泛应用于囊性纤维化等遗传性疾病的诊断、各种呼吸道病毒的鉴定和人乳头瘤病毒的分型。

2.微流控芯片

1992年，Harrison等人【11】首次提出将毛细管电泳和进样设备集成到固体玻璃载体中，构建“微全分析系统”的设想。通过分析设备的小型化和集成化，完成了从传统分析实验室向片上实验室的转变。微流控芯片由微型流体管、反应器等部件组成。与宏观尺寸的分析装置相比，其结构大大增加了流体环境的面积/体积比，从而最大限度地利用液体与物体表面相关的特殊性质，包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应，从而在一个芯片上完成进样、预处理、分子生物反应和检测等一系列实验过程。

利用微流控芯片并行检测多基因位点是目前临床应用的主要领域。

双核酸的序列测定

测序反应是直接获取核酸序列信息的唯一技术手段，是分子诊断技术的一个重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量聚合酶链反应技术近年来取得了很大进展，但它们对核酸的鉴定仅停留在间接推断的假设上。因此，核酸测序仍然是基于特异性基因序列检测的分子诊断的技术金标准。

(一)第一代测序

1975年，桑格和库尔森发表了加减法测定DNA序列的方法，然后无极生组合在1977年提出了化学修饰和降解的模型，拉开了核酸测序时代的序幕。

同年Sanger等人【12】提出的末端终止法(Sanger测序法)是利用2’和3’不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应，ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此DNA合成反应将被终止。如果在四个独立的DNA合成反应体系中加入核素标记的特异性ddNTP，合成反应结束后可以对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和放射自显影，根据电泳条带可以确定待测分子的核苷酸序列。基于桑格的方法，Appied Biosystems于1986年推出了第一台商用DNA测序仪PRISM 370A，用荧光信号接收和计算机信号分析取代了放射性核素标记和放射自显影检测系统。该公司于1995年推出的第一台毛细管电泳测序仪PRISM 310极大地提高了测序通量。桑格测序是最经典的一代测序技术，也是目前获取核酸序列最常用的方法。

(2)第二代测序

1.焦磷酸测序

不同于桑格测序法使用的合成后测序概念，Ronaghi在1996年和1998年分别提出了固相[13]和液相[14]载体合成的同时测序的方法——焦磷酸测序法。其基本原理是利用引物链延伸时释放的焦磷酸基团激发荧光，通过峰值判断与之匹配的碱基数量。由于实时荧光监测的概念，焦磷酸测序可以量化特定位点的碱基负载率，因此广泛应用于SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测。由于荧光报告的原理不同，通过桑格测序，其对序列变异的敏感性从20%增加到5%。然而，由于仪器采购成本高，检测单一，该技术尚未在大规模临床实践中使用。

2.高通量第二代测序

目前常见的高通量第二代测序平台主要有罗氏454、Illumina Solexa、ABI固相和Life Ion Torrent等。都是通过DNA片段化构建DNA文库，通过与载体交联扩增文库，在载体表面合成的同时进行测序反应，使得第一代测序中基于96孔板的最高平行通量扩大到载体上百万个平行反应，完成海量数据的高通量检测。这项技术可以检测基因组、转录组等。在指导疾病的分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、鉴定传染病病原微生物的宏基因组、通过母亲体内胎儿DNA信息进行产前诊断等方面取得了可喜的成绩。但由于这种技术需要对DNA进行片段化，测序反应的阅读长度较短(例如Solexa和SOLiD系统的单次阅读长度只有50bp)，需要对数据进行大规模拼接。因此，要求分子诊断医师掌握生物信息学知识，有利于后期测序数据分析。

(3)第三代测序

第三代测序技术的核心思想是以单分子为靶点边合成边测序。目前，该技术的操作平台主要包括Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和牛津纳米孔技术公司的纳米孔技术。该技术进一步降低了成本，可用于混合遗传物质的单分子检测，因此鉴定SNP和CNV更有效。然而，要将其商业化并最终投入临床应用，还有很长的路要走。

第三，基于分子构象的分子诊断技术

(1)变性梯度凝胶电泳(DGGE)和单链构象多态性(SSCP)

从1970年到1980年，Fischer等人[15]和Orita等人[16]分别提出了通过变性和非变性PAGE分离和鉴定变异序列的方法，即DGGE和SSCP利用双链变性条件的差异和单链折叠的差异空。上述两种技术是通过在空中突变的核酸分子之间的构象差异和特定条件下电泳速率的变化来检测的。因为核酸分子的构象是序列特异性的，对序列变化敏感，通常也可以识别一个碱基的变化。然而，DGGE和SSCP在聚合酶链反应后必须进行开盖电泳，这在现在的临床检测中并不常见。

(2)变性高效液相色谱

1997年，Oefner和Underhill建立了[17，18]通过异源双链变性分离变异序列并通过色谱洗脱进行鉴定的技术，称为dHPLC，它可以自动检测单碱基置换和核苷酸小片段的插入或缺失。变性复性后，核酸双链混合物中会出现两种具有一定比例变异序列的双链:一种是同源双链，由野生型有义链-野生型反义链或变异型有义链-变异型反义链组成；另一种是异源双链，即一条单链为野生型，另一条为变异型。由于部分碱基错配的异源双链DNA的解链特性与同源双链DNA不同，在相同的部分变性条件下，异源双链由于错配区域的存在更容易变性，且异源双链经色谱柱的保留时间比同源双链短，因此先洗脱，从而在色谱图中呈现双峰或多峰洗脱曲线。由于该技术采用分析灵敏度高的色谱技术进行检测，因此可以快速检测

(3)高分辨率熔融分析(HRMA)

2003年，Wittwer等人【19】首次使用过饱和荧光染料被动标记PCR产物的全长，然后通过简单的产物解链分析鉴定单碱基变化。这种技术的原理是通过异源双链来识别序列变异。PCR扩增后，序列变异的杂合子会形成异源双链，其解链温度会大幅下降。此时由于双链完全被饱和染料填充，其产物的熔融温度变化可以通过熔融曲线的差异来判断。对于纯合变异，HRMA也可以利用其高分辨率鉴别PCR产物的单位点A:T双键对和G:C三键对的热稳定性差异，但不能有效区分II类和III类SNP的纯合变异。

如何利用DNA构象来推断序列，从而避免昂贵的序列测定或繁琐的杂交反应，一直是分子生物学研究和应用的热点问题。目前，通过构象变化间接检测序列变异的方便性已经得到一致肯定，特别是HRMA可以在单个封闭试管中完成变异序列的扩增检测反应。但需要注意的是，大多数基于构象变化的分子检测方法并不能严格保证探针杂交或核酸序列测定检测的特异性，因此只适合大规模的初筛，真正的诊断还是需要通过杂交或测序来验证。

二次聚合酶链反应(定量聚合酶链反应，定量聚合酶链反应)

与其他分子诊断检测技术相比，qPCR有两个优点，即通过荧光信号在同一个封闭系统中进行核酸扩增和检测，消除了PCR后开盖处理对扩增产物的污染；同时，低拷贝模板可以通过动态监测荧光信号来量化。由于上述技术优势，qPCR已经成为临床基因扩增实验室中最被接受的技术，并已广泛应用于各种临床实践中，如各种病原微生物如病毒和细菌的鉴定、基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监测等。然而，随着qPCR技术的快速发展，该技术的质量管理问题日益突出。如何消除各种生物变量引起的检测变异，减少或抑制实验操作和方法学上的各种干扰因素，是qPCR技术面临的难题。

(1)实时聚合酶链反应

1992年，Higuchi等人([20-21)通过向聚合酶链反应溶液中加入溴化乙锭，测量了核酸扩增每个热循环后的荧光强度，并提出了一种实时聚合酶链反应模型，利用荧光强度和热循环数绘制的核酸扩增曲线来量化反应体系中初始模板的反应动力学，开创了通过在实时封闭管中检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以包埋在DNA双链中，只有包埋在DNA双链中才能释放荧光。每个扩增循环后，检测反应管的荧光强度，绘制荧光强度-热循环数的S型核酸扩增曲线。以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影为循环阈值(CT)，Ct与反应体系中包含的初始模板数呈负指数关系，可以推断出初始模板量。随后，莫里森·[[22]提出了用高灵敏双链染料SYBR Green I定量反应体系中低拷贝模板的方法。这种方法操作简单，但其产物的特异性不能完全保证，因为只有扩增引物的序列用于启动核酸扩增。虽然经过实时荧光定量PCR反应后可以用熔解曲线来检测产物的特异性，但其特异性明显不如荧光探针检测的特异性，因此双链掺入法在临床上尚未得到认可。

2.Taqman探针

1996年，海德·[[23]综合Taq酶的5’核酸酶活性和荧光共振能量转移(fret)探针的概念，提出了一种利用Taqman探针进行qPCR的方法。TaqMan探针的本质是FRET寡核苷酸探针，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。Taq酶具有5’3’核酸外切酶活性，与靶序列结合的寡核苷酸探针在PCR过程中水解，使荧光基团游离，释放荧光信号。因此，能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中能够释放荧光，荧光可以通过实时聚合酶链反应的原理进行定量。Taqman探针因其高特异性和成功商业化，已成为临床上应用最广泛的qPCR方法，在各种病毒基因的定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面发挥着不可替代的作用。

3.分子信标

1996年，Tyagi等人【24】提出了利用分子信标进行qPCR的方法，分子信标是在5’端和3’端分别带有荧光报道基团和淬灭基团的寡核苷酸探针，两端带有互补的高GC序列，在qPCR反应液中具有发夹结构，荧光基团和淬灭基团之间发生荧光共振能量转移(FRET)，从而保持静止状态。当聚合酶链反应开始时，茎环在变性高温下打开，释放荧光。在退火过程中，目标序列特异性探针与模板杂交以保持线性，而不能与模板杂交的探针被复性至茎环并荧光淬灭。通过检测qPCR系统退火过程中的荧光信号强度，可以利用实时聚合酶链反应原理特异性地检测系统中的初始模板浓度。与Taqman探针相比，分子信标利用发夹结构使荧光基团和淬灭基团紧密结合在空之间，大大降低了检测的荧光背景。其检测特异性高于Taqman探针，更适合等位基因分型检测。

4.双混合探针

1997年，Wittwer等人[25]发表了qPCR方法，使用两个相邻的寡核苷酸探针分别标记荧光供体基团和荧光受体基团。双杂交探针标记的供体基团和受体基团的激发光谱有一定的重叠，两个探针与靶核酸的杂交位置应相邻。只有当两个探针同时与靶基因杂交时，供体基因和受体基因相互靠近，从而通过FRET发生能量转移，激发荧光信号。荧光信号的强度与反应体系中靶序列DNA的含量成正比。由于采用两种探针进行靶序列杂交，因此与传统的单探针检测系统相比，该方法的特异性大大提高。

(2)数字聚合酶链反应

早在20世纪90年代，就出现了用微流控阵列分散检测单个qPCR反应的概念。基于这一思想，Vgelstein和Kinzter[26]于1999年发表了Digital PCR的方法，对结肠癌患者粪便中K-RAS基因的微量突变进行了量化。与传统的qPCR方法相比，数字PCR的核心是在qPCR反应中液化微球乳糜，然后将乳糜液分散到芯片的微反应孔中，以保证每个反应孔中只存在≤1个核酸模板。聚合酶链反应后，检测每个微反应孔的荧光信号，带有目标核酸模板的反应孔将释放荧光信号，没有目标模板的反应孔将没有荧光信号，从而计算出原始溶液中待检测核酸的浓度。因此，数字聚合酶链反应是一种在反应结束时检测荧光信号并进行绝对定量的qPCR反应，而不是基于模板Ct值进行核酸定量的实时聚合酶链反应。

Quantalife开发的微滴数字PCR(2011年由BIO-RAD收购)是第一个商业化的数字PCR检测系统，已广泛应用于微病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异、单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统的qPCR相比，该技术具有更高的灵敏度和精度，是qPCR领域的一颗新星。

未来五年的五大前景

分子诊断在过去半个世纪的快速发展离不开分子生物学技术的快速进步。综上所述，50年来，分子诊断技术有了三大转变和三大改进:即报告信号的检测由放射性核素标记转变为荧光标记，操作方法由手工操作转变为全自动化，检测分析通量由单标记转变为高通量多组联合判断；检测的灵敏度、精密度和特异性迅速提高。

未来五年，中国的分子诊断将在两个方面取得进展。随着卫生监督部门对分子诊断重要性认识的不断深入和越来越多高学历、高素质人才的进入，分子诊断的概念将会有革命性的进步，高通量技术将会更多地应用于临床。随着技术的进一步发展，传统的特异性基因异常和病原微生物感染的鉴定方法在分析性能和操作方便性方面也将取得很大的进步。对于人工和时间成本高的传统检测方法，会出现两极分化的趋势，即保留Southern等经典检测金标准；但ASO-RDB等敏感性和特异性不能满足实际临床需要的方法将很快被新技术取代。分子诊断最终必将改变目前仅用于病原微生物基因检测和某些遗传性疾病诊断的现状，形成肿瘤学、遗传学、微生物学和药物基因组学的快速发展。