顺反子 CHO细胞表达重组单克隆抗体载体的构建策略

抽象的

近年来，重组蛋白已被用于不同疾病的治疗，其中单克隆抗体是生物治疗中发展最快的重组蛋白。CHO细胞是生产这些重组蛋白最广泛使用的细胞株，表达载体决定了重组蛋白的表达量和质量。目前，CHO细胞表达载体的构建策略已经建立，包括单顺反子载体、多启动子表达载体、IRES(内部核糖体进入位点)或弗林-2A(弗林-2A多肽)介导的三顺反子载体。其中，弗林-2A介导的载体非常有效，其优点是自切割效率高，在同一个开放阅读框中具有相同的轻链和重链表达。本文综述了这些在CHO细胞中构建重组单克隆抗体表达质粒的策略的发展过程和优缺点。

正式介绍

随着基因工程的发展，对重组治疗蛋白的需求大大增加[1，2]。作为一种重要的重组蛋白，治疗性单克隆抗体具有特异性和低免疫原性。近年来，重组单克隆抗体已成为治疗包括癌症和免疫系统缺陷在内的许多疾病的主要药物[3，4]。到目前为止，FDA(美国食品药品监督管理局)和EMA(欧洲药品监督管理局)已经批准了70多种治疗性单克隆抗体，其中39种是由CHO细胞产生的(见表1)，此外还有数百种单克隆抗体处于临床阶段。

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重组单克隆抗体或基因修饰抗体通过转基因技术在各种宿主细胞中表达。免疫球蛋白GmAbs(IgGmAbs)由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。重组单克隆抗体需要适当折叠、组装和糖基化才能具有生物活性[6]。不同宿主细胞产生的治疗性单克隆抗体表现出不同的免疫原性和治疗效果，提示宿主细胞影响重组单克隆抗体的生物学功能[4]。大肠杆菌表达系统是一个简单的系统，其转录后修饰越来越不常见，所以这个系统只适合表达抗体片段或单链抗体[7，8]。昆虫细胞、酵母细胞和转基因植物的转录后修饰与人类细胞不同，导致重组单克隆抗体与人类天然单克隆抗体有很大差异治疗性重组单克隆抗体需要适当的糖基化和其他翻译后修饰才能实现其生物学功能。因此，大多数治疗性重组单克隆抗体是由哺乳动物细胞产生的，CHO系统最常用作表达系统多启动子单克隆抗体的表达载体具有不同的启动子，分别介导轻链和重链基因的转录(图1b)。目前用于CHO细胞表达系统的启动子主要来自猿猴空囊泡病毒40(SV40)、延伸因子-1α(EF-1α)和巨细胞病毒(CMV)。当然，EF-1α是最强的启动子前景(表2)。Bayat等人利用巨细胞病毒启动子构建了单顺反子载体、双载体和双顺反子载体，并用于表达重组单克隆抗体。发现双启动子表达的蛋白质产量最高[5]。然而，每个启动子负责一个基因在多启动子载体上的转录，这可能导致基因表达水平的不平衡已经建立了多种重组单克隆抗体表达载体的构建策略，并产生了一系列载体，如单顺反子载体、多启动子载体和IRES或福林-2A介导的三顺反子载体。这些载体各有利弊。其中，弗林-2A介导的载体是最有效的表达载体，具有自切割效率高、轻链和重链表达量相等的突出优势。今后，我们认为未来的研究应侧重于利用顺式元件增加重组单克隆抗体的表达。此外，提高弗林-2A介导的载体的自切割能力也将是确保轻链和重链蛋白质准确和相同表达的优势。。以单克隆抗体为例，这将导致轻链和重链的表达水平不一致，导致两个启动子之间相互干扰或抑制。此外，在许多情况下，多启动子载体的能力是有限的，因此很难适应两个以上的转录盒。因此，这种方法的应用是有限的。。与其他表达系统相比，CHO细胞具有以下优点:(1)更适合悬浮培养，满足大规模工业化生产的需要三顺反子载体；(2)产生的单克隆抗体更接近天然单克隆抗体的结构和功能；(3)人类病毒不能在这些细胞中被感染和扩增三顺反子载体在一个mRNA上表达轻链和重链，筛选标记基因，允许三个基因同时表达，将传统载体的上述表达问题降到最低。三顺反子载体轻链和重链的表达水平相同，使得单克隆抗体的表达水平更高，聚集率更低，糖基化一致。有两个三顺反子向量，一个是IRES向量，另一个是弗林-2A向量。；(4)外源基因可以稳定整合到CHO细胞中；和(5)当在CHO细胞中表达治疗性重组单克隆抗体时，需要同时翻译HC和LC基因，这与细胞系的成功转染一起，是CHO细胞产生单克隆抗体的主要挑战。。与其他系统相比，哺乳动物细胞产生的治疗性重组蛋白具有正确的转录后修饰，相似的分子结构和糖基化，与人体内的抗体接近构建表达载体的策略。因此，除了一些抗体片段，市场上大多数治疗性单克隆抗体是由哺乳动物细胞产生的[11-13]，优选CHO细胞表达系统。表达载体是CHO细胞表达不同重组蛋白的关键因素，决定了单克隆抗体的产量和质量多启动子表达载体。本文详细介绍了利用CHO细胞表达系统构建单克隆抗体表达载体的最新进展。

CHO细胞表达系统

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单顺反子载体

近年来，已经建立了在CHO细胞中表达单克隆抗体的表达载体的不同构建策略(表2)。早期的研究集中在使用独立的载体和表达轻链或重链序列(图1a)[18，19]。然而，这种策略既耗时又困难，并且准备和高效地共同转移两个载体是一个挑战。此外，两种筛选标记的使用降低了获得稳定细胞克隆的效率[20，21]。此外，两个筛选标记和靶基因低效整合到细胞基因组DNA中影响轻链和重链基因的表达。相比之下，瞬时表达使得分析哺乳动物细胞中的蛋白质表达更加有效IRES是数百个碱基的非编码序列，位于一些病毒基因组中，通常在RNA病毒的5’非编码端。IRES可以介导独立于5’hat结构的翻译起始，并且可以促进单个mRNA转录物上多个基因的表达[28]。在翻译过程中，IRES元件促进帽子独立结构的启动和IRES元件下游基因的翻译参考文献:。在该策略中，IRES元件被插入轻链和重链阅读框的中间，包括重链、IRES和轻链的整个序列由一个启动子转录(图1c)。在翻译阶段，第一个开放阅读框架由hat结构的机制介导，而IRES下游的第二个阅读框架由一个独立于hat结构的机制执行[28，30，31]。因此，实现了启动子可以表达完整重组蛋白的假设。。单顺反子载体瞬时转染用于筛选早期抗体分子，但其表达水平低于双启动子和双顺反子载体[5]。这可能归因于这种单顺反子载体系统的每个多肽链都由其自身独立的启动子介导，轻链由于其较低的分子量而在转录和翻译中更有效[23，24]。单顺反子系统的这些缺点不仅增加了工作量，而且不适合大规模生产单克隆抗体[25，26]。因此，需要构建多顺反子质粒，在同一载体上实现轻链和重链，筛选基因。

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图1:构建单克隆抗体表达载体的示意图

a:单顺反子载体，b:多启动子载体表达系统，c: IRES介导的载体，d:弗林-2a介导的载体。GOI:插入基因，聚腺苷酸:聚腺苷酸化信号，IRES:核糖体内部进入位点，f2a: furin-2a。

IRES介导的载体

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IRES的使用克服了单顺反子载体和多启动子表达载体中不同启动子相互干扰的问题[32]。在单顺反子载体系统中，靶蛋白和筛选标记基因受不同启动子的控制，导致获得表达所有基因的克隆的概率低[33，34]。在这个系统中，筛选基因也通过IRES元件连接，因此轻链和重链以及筛选基因可以在同一转录本中表达，从而增加了阳性克隆的概率[18，28]。此外，系统中轻链和重链的三顺反子表达水平是一致的，这降低了单克隆抗体的产量[28]。例如，抗肿瘤坏死因子α的单克隆抗体(由IRES介导的三顺反子系统在CHO细胞中表达)的抗体产量明显高于双质粒系统[35]。然而，Hennecke等人发现，非帽子结构依赖的翻译效率低于帽子结构依赖的翻译效率[36]。因此，虽然所有的基因都在同一个转录的mRNA中，但它们的翻译水平是不同的。因此，靶基因的测序设计对于构建单克隆抗体的表达载体尤为重要[37]。

弗林-2A介导载体

2A多肽是一种自切割多肽，最早发现于RNA病毒中，主要包括四种类型，分别来源于手足口病病毒(F2A)、马鼻病毒(E2A)、猪肠道病毒1型(P2A)和昆虫病毒(T2A)。这个2A序列比IRES小得多，只有大约20个氨基酸。2A序列插入轻链和重链之间，独立的轻链和重链通过2A序列c端最后两个氨基酸GP之间的共转录和剪切产生，这增加了共表达蛋白质的产量(图1d)[37，38]。2A介导的自切割机制跳过了核糖体上2A序列碳末端甘氨酰脯氨酰的形成[39，40]。

以前的研究表明，在2A序列之前添加弗林序列可以在剪切后去除多余的氨基酸[41，42]。无论转化是短暂的还是稳定的，单克隆抗体在弗林-2A介导的载体中的表达水平都高于IRES介导的载体[18，42]。此外，F2A序列上游基因的翻译效率高于下游基因[18]，因此F2A序列两侧重链和轻链的排列影响单克隆抗体的产量。发现高轻链表达与高细胞活力、高单克隆抗体产量和低聚集有关[23]。当构建多顺反子载体时，结合2A和IRES序列将提高效率李、田ZW、徐DH、王XY、王TY。CHO细胞中重组单克隆抗体表达载体的构建策略。Mol Biol代表，2018年12月；45(6):2907-2912.，但是仍然存在许多挑战。首先，弗林-2A自剪切不完全(85-95%)，这将降低效率。此外，2A多肽的碳末端可能影响蛋白质的功能和定位[26]。

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