【2013诺贝尔生理学奖】你所不知道的“外泌体”：有好的，也有坏的

写作：波波老师

资料来源：干细胞者说

外分泌体无疑是这几年的热点，无论是基础研究还是技术开发都在指数上升。

在过去短短几年里，外泌体赚足了眼球，也受到了资本的大力追捧，呈现出一派欣欣向荣的景象。关于外泌体，“干细胞者说”科普文章里中不只提到过一次，大家并不陌生。还是那句话，不管市场怎么吹捧，在知识层面，我们要有正确的认识。

1 外泌体是人体的“顺丰快递”

2013年，诺贝尔生理学或医学奖授予了三位科学家，表彰其在细胞间囊泡运输调控机制领域作出的突出贡献。诺奖的加持，使得外泌体及其生理学功能成为热点，得到广泛研究。

外泌体是一种直径为30-150nm的细胞外囊泡，具有独特的介导细胞间通信和相互作用。从制药角度来看，外泌体是内源性脂质纳米颗粒（LNP），由真核细胞产生，被双层脂质膜包裹。

一种理解外泌体的简单方法，外泌体是人体的天然“顺丰快递”通道。作为细胞间的一种通讯方式，人体几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，外泌体广泛存在并分布于各种体液（例如血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中）中，携带多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质类物质等。

外囊泡三剑客：凋亡小体、微泡、外泌体

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）是机体远距离细胞间交流的一种手段。关于外囊泡来源和命名存在着很多混淆，叫啥的都有。目前主要被分为3大类：外泌体、微泡和凋亡小体。临床研究中主要关注的是外泌体和微泡。其实这两个也不好分。

外泌体的大小、形状和类型也不尽相同。重要的是，它们有不同的表面特性和分子组成。它们的外膜包含不同的表面标记物，其中，典型的是跨膜四蛋白CD9、CD63和CD81。

总结来说，外泌体的基本信息概括如下：

外泌体基本信息概括：

外泌体大小：直径约30-150nm

微囊泡大小：直径为100nm-1μm

从研究上来讲，并不严格区分外泌体（exosomes）或微泡（microvesicles）。

外泌体数量：人体中大约有10*14个，平均每个细胞产生1000-10000个

外泌体来源：人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体

外泌体异质性：即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别

外泌体存在：外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中。

2 外泌体有好的，也有坏的

外泌体研究领域发展迅速，但许多科学问题仍未得到解答。例如人体中大约每天产生10*14个外泌体，近乎于平均每个细胞产生1000-10000个。如何利用来自这么多形形色色的外泌体呢?

外泌体起源于细胞内吞过程中形成的内体，再从细胞中释放到胞外。几乎所有细胞都可以分泌外泌体。干细胞里有外泌体，可能具有抗炎和组织再生作用，这属于好的外泌体。肿瘤细胞里也有外泌体，可能进一步促进肿瘤的发生发展，这就是坏的外泌体了。

干细胞外泌体

干细胞外泌体具有免疫调节、抗炎和抗纤维化、抑制氧化应激、增强血管生成等作用。这主要依赖于其中的蛋白和核酸组分。例如间充质干细胞（MSCs）外泌体富含糖酵解相关酶，可增加ATP的产生，减少组织细胞死亡。MSCs外泌体还含有VEGF、TGF-β、IL-6、IL-10和HGF等细胞因子，有利于血管生成和免疫调节。

• 2018年5月，FDA批准了Aegle公司的首个细胞外囊泡新药临床试验申请，以开始用于烧伤患者的临床试验。通过分离纯化MSCs分泌的细胞外囊泡，用以治疗严重的皮肤病，包括烧伤和大疱性表皮松解症。

• 2019年6月，United Therapeutics宣布其基于外泌体治疗支气管肺发育不良（BDP）的 I 期试验获批开展。

• 2020年1月，Exopharm宣布了其在人类临床试验中的首次给药，成为首家测试外泌体对伤口愈合能力的公司。Exopharm的Plexaris产品，是无细胞的血小板外泌体制剂，在临床前动物研究中，改善了伤口闭合，并减少了疤痕。

如何提高外泌体的分泌量。在外界刺激条件下，体外培养中的细胞会产生更多的外泌体，外泌体的内容物也会发生变化。例如，缺氧、缺营养或其它应激会产生具有不同的外泌体，可能会产生不同的“货物”信息。培养条件和培养时间也会影响细胞产生的外泌体的类型和功能。

间充质干细胞（MSCs）具有治疗多种疾病的潜力，包括膝关节炎、移植物抗宿主病、神经系统疾病（如帕金森病、中风、阿尔茨海默病等）。实验室条件下，MSCs 可经体外培养扩增。但每次扩增干细胞外泌体的分泌数量是不同的；或许每次扩增，分泌的外泌体类型也是不同的。

肿瘤细胞外泌体

多年来，肿瘤学家一直在寻找用于肿瘤早期检测和癌症复发监测的生物标志物。外泌体可以提供一种潜在的解决方案，因为肿瘤细胞产生的外泌体与非肿瘤宿主细胞产生的外泌体不同，在肿瘤生长和最终转移中发挥着重要作用。问题的关键是在于找到特异性肿瘤外泌体，并弄清它们的内容物。

肿瘤细胞的外泌体，含有大量与肿瘤相关的核酸和蛋白，在癌症发生和早期检测中具有重要的研究和应用价值。

外泌体内容物作为肿瘤的潜在诊断标志物

那么，问题来了。面对纷繁复杂的外泌体，如何鉴别来自不同细胞的外泌体和来自同一细胞的不同外泌体?

3 外泌体的复杂多变

随着外泌体行业的快速发展，分离和鉴定外泌体亚群的工作变得越来越重要。外泌体亚群对基础科研、诊断疾病和治疗药物的开发至关重要。

如果对外泌体进行分析，可以发现同一种细胞来源的会产生不同的外泌体。即使是同一种细胞的外泌体，纯化后具有不同的形态。外泌体亚群有很多不同：大小、形状、密度、膜表面受体、荷载以及细胞来源。

外泌体在尺寸、内容物、功能和来源均有差异性

鉴定外泌体亚群的最好方法是表面标记物，可以利用外泌体不同的表面标记物进行免疫捕获，鉴定并分选出特定的外泌体亚群，以用于诊断或治疗目的。

使用不同的细胞培养基，也会影响外泌体的内容物和类型。此外，如果使用含有血清的细胞培养基，可能原本就含有外泌体，这使收获的外泌体分析更加复杂。不同的外泌体，即使来自同一细胞中，也会给产业化带来无尽的困扰。

科学家们已经认识到外泌体研究的复杂性。然而，正是外泌体的这些复杂性，可以让我们区分外泌体亚型、功能和“身份”，在症状出现之前，更早地识别疾病状态，并促进针对许多疾病的潜在治疗。尽管外泌体拥有无限应用前景，但也有很多挑战，包括制备均一稳定的外泌体产品，且制备方法可重复。

4 外泌体的成药可能性

如今，众多企业正在开发外泌体治疗或诊断方法，针对纯天然和工程化的外泌体产品进行临床试验。一点也毫不奇怪，许多细胞企业也在向外泌体领域拓展。迄今为止，全球约有40多家外泌体治疗和诊断的公司（完整数据索取，请评论处留下您的邮箱）。

基于外泌体治疗的部分企业

基于外泌体诊断的部分企业

目前，许多基于外泌体的I/II期临床试验正在进行。不同细胞来源的外泌体，在体内显示不同的归巢能力，这可能是与其膜表面受体和细胞外基质结合蛋白有关。静脉注射是基于外泌体递送药物中使用最为广泛的给药途径。腹腔注射、瘤内注射、口服和鼻腔喷雾给药也在多种疾病动物模型中得到了尝试。静脉注射外泌体24h后，肝脏中荧光信号最强，其次是脾脏、胃肠道和肺部。因此，外泌体注射后的分布，以及长期的影响和安全性，仍将需要进一步探索和阐明。

外泌体载药可以分为三种：外源性载药、内源性载药和转基因。

• 外源性载药方式：先分离外泌体，再将药物通过转染或电穿孔导入外泌体；

• 内源性载药方式：先将药物导入细胞中，当药物进入外泌体且从供体细胞中释放后，分离纯化得到载药外泌体；

• 转基因方式：通过转基因的方式让细胞自身表达，最终随外泌体分泌至细胞外。

外泌体规模化应用开发关键在于三点：一是依赖于细胞规模化培养条件的提升。二是依赖于外泌体分离纯化方法的提升。三是依赖于外泌体亚群的鉴定分离。

总结来说，外泌体在诊断和治疗应用方面的关键特征包括：

外泌体关键特征概括：

外泌体是纳米大小、膜结合的囊泡。

外泌体在细胞通信和调节中发挥着不可或缺的作用。

外泌体膜含有针对特定细胞类型的表面标记物。

外泌体不是细胞，无免疫原性，且更稳定，更易处理。

外泌体可能具有很大功能区别，即使是同一种细胞分泌。

外泌体的内容物包含蛋白质、RNA、DNA和脂类，易被邻近或远处的细胞捕获内吞，并调节受体细胞。

外泌体药物生产工业化（规模、纯度、成本、一致性和标准化）是目前面临的重大挑战。相信未来几年，从事外泌体产品开发的项目或企业将不断增加，最终外泌体产品将走向商业化，造福患者。

听说，美国FDA批准Direct Biologics公司启动一项I/II阶段试验，以评估ExoFlo™治疗新冠肺炎综合症。ExoFlo™产品是一种从人骨髓间充质干细胞 (BM-MSCs) 中分离的cGMP级细胞外泌体。

外泌体，你可以吗？

参考资料（部分）

1.Exosomes: composition, biogenesis and function." Nat Rev Immunol2(8): 569-579.2002

2.Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol 200(4): 373-383.2013

3.Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities." Nat Rev Drug Discov12(5): 347-357.2013

4.Human umbilical cord mesenchymal stem cells and exosomes: bioactive ways of tissue injury repair[J].Am J Transl Res. 11(3): 1230–1240.2019;

5. Forsberg M H , Kink J A , Hematti P , et al. Mesenchymal Stromal Cells and Exosomes: Progress and Challenges[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2020, 8.

6.

谁持彩练当空舞 ：干细胞基础与临床研究进展

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