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实时荧光定量聚合酶链反应引物设计

实时荧光定量聚合酶链反应是实验室中最常用的实验。研究基因的mRNA表达水平,验证基因敲除后下游靶基因的变化。

首先,实时荧光定量聚合酶链反应是一种用荧光化学物质在DNA扩增反应中测量每个聚合酶链反应循环后产物总量的方法。通过内部参考或外部参考对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

最常用的方法是SyBrGreenⅰⅰ和TaqMan探针法。下面介绍原理:

1.

SYBRGreenⅰⅰ方法:

在聚合酶链反应体系中,加入过量的SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性掺杂到DNA双链中,然后发出荧光信号,而未掺杂到链中的SYBR染料分子不发出任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与聚合酶链反应产物的增加完全同步。

2.

TaqMan探测方法:

探针完成后,报道基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收;在聚合酶链反应扩增过程中,Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性降解探针,并将报告荧光团与淬灭荧光团分离,使得荧光监测系统可以接收荧光信号。所以他每扩增一条DNA链,就形成一个荧光分子,荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步。

在设计实时荧光定量聚合酶链反应引物之前,每个人都应该知道引物设计中应该注意的一些细节和原则。

这里有两个在线设计实时荧光定量PCR引物的网站,不需要安装软件就可以直接在网上完成。

一个

黄金银行.

网站:https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

1.首先,进入网站主页,选择关键词,根据自己的需要选择物种和基因名称。

2.点击提交,出现如下界面。网站会推荐多对引物,可以根据引物长度和Tm值进行选择。

Primer3plus .

网站;http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

1.PUBMED获得基因序列后,在primer3plus主页上输入基因序列。

2.单击常规设置设置引物扩增长度。一般可以把扩增长度设置的大一些,然后根据推荐的引物选择合适的扩增长度。

3.点击选择引物后,您将首先看到一对首选引物和引物在序列中的位置。引物的Tm值和GC含量可以在Primer3plus网站上看到。

设计引物后,

最好在NCBI BLAST检查一下引物的特异性,然后交给公司合成。

1.进入pubmed主页,点击BLAST中的nuclear BLAST。

2.选择一个引物序列并将其输入对话框,然后单击BLAST。

3.网页打开后,会看到如下界面。不同的颜色代表引物序列的得分,一般会选择40分以上,也就是至少蓝色。继续下拉网页查看序列详情,物种分类,基因名称,序列位置。

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