豆柏 别当Out曼！您须知道的发酵豆粕指标测定说明

发酵豆粕中的小肽和抗原蛋白是衡量质量的两个重要指标。长期以来，我国发酵豆粕产品主要由乳酸菌通过厌氧发酵生产。为方便起见，业界通常采用酸溶蛋白法测定小肽含量，ELISA法测定抗原蛋白含量。然而，随着发酵技术的提高，芽孢杆菌好氧发酵生产的发酵豆粕在国内市场上逐渐显示出优势。这两种测定方法是否适用，能否作为客观反映小肽和抗原蛋白真实含量的指标？

1小肽-酸溶蛋白法

①不同酸碱度下发酵(或水解)的豆粕在酸中的溶解度不同

微生物发酵过程中蛋白质的分解本质上是微生物产生蛋白酶的功能。但不同酸碱蛋白酶酶解豆粕得到的小肽在酸中的溶解度不同，其中酸性蛋白酶水解的小肽96%能溶于三氯乙酸，碱性蛋白酶水解的小肽不到50%。因此，酸溶性蛋白更适合评价酸性发酵或酶解的豆粕产品，而芽孢杆菌发酵的中碱性产品中小肽的含量，如CJ表达肽，会被低估(刘慧珍，江南大学硕士论文，2007)。55%粗蛋白产品的酸溶性蛋白相对较低(6-10%)。

②小肽要有明确的分子量定义

国家食品标准gbt22492 (2008)将小肽的定义从< < 10 KDa降低到< < 5 KDa。在营养学上，小肽的定义略有不同，但以分子量范围来定义是共识。高效凝胶过滤色谱是测定小肽含量和蛋白质分解度的“金标准”。该方法以多孔填料为固定相，根据分子体积的不同对样品进行分离。在肽键紫外吸收波长为214nm的条件下，用凝胶色谱法测定分子量分布。研究还表明，发酵豆粕中大分子蛋白质的分解程度(蛋白质和肽的分布)与仔猪小肠绒毛的结果和生长性能有关(张璐璐等人，2016年)。传统的酸溶性蛋白质不能区分蛋白质氮、游离氨基酸氮和非蛋白质氮，也不能给出明确的分子量。

③酸溶性蛋白仅反映了速溶益肽小肽含量的一小部分

杰西研究所发现发酵豆粕样品的全蛋白分布(红色峰)和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布(蓝色峰)同时测定。三氯乙酸提取的蛋白质分子量小于5kDa，在红色光谱和蓝色光谱之间有一个灰色区域，这是样品中三氯乙酸不能提取的肽含量，即三氯乙酸不能完全溶解样品中的所有肽，只能溶解一小部分(如下图)。

2抗原蛋白-ELISA法和SDS法

①采用酶联免疫吸附法检测加工豆制品的缺陷

致敏的不确定性:目前有商品化的大豆抗原蛋白检测试剂，包括大豆球蛋白检测试剂盒和β-伴大豆球蛋白检测试剂盒，但另外两种大豆抗原蛋白Gly m Bd 30K和Gly m Bd 28K没有商品化的试剂盒。这两种抗原蛋白分别被65%和25%的大豆过敏患者血清识别。目前市售β-伴大豆球蛋白的α亚基与α′亚基和β亚基同源性较高，分别为90.14%和76.2%，但α′亚基和β亚基不是致敏蛋白。

变化很大:目前主流的商业试剂盒方法不适用于热加工大豆产品。首先，蛋白质变性和美拉德反应都会影响产品在热处理过程中的抗原提取率，而目前主流商用试剂盒中使用的Tris-Hcl提取物的实际抗原提取率不到50%，差异较大(如下图所示)。

假阳性:目前主流的商业试剂盒方法在测定发酵或水解大豆制品时存在争议。在分解过程中，大豆抗原蛋白亚基(抗原活性的基础)一方面通过降解降低抗原活性，另一方面也会导致更多的表位暴露，从而增加“所谓的”抗原活性，但这种活性是否能引起过敏反应尚不清楚。一般认为抗原的分子量一般在10 KDa以上，具有良好的抗原活性，分子量需要超过500 KDa。传统的营养理论也认为只有完整的抗原亚单位进入血液才能导致致敏反应。所以CJ认为SDS是鉴定抗原降解的有效方法，并以最小亚基分子量30 KDa作为豆粕的降解标准，如下图所示。

②酶联免疫吸附法测定食品抗原的探讨

影响因素:

提取方法；水解或发酵；热加工；交叉反应

结论:

FDA（2005）认为多数ELISA方法可能并不适用；ELISA检测不出也不能判断无抗原活性，建议用Western判定

③注意事项③SDS电泳测定抗原

抗原提取率:不同溶剂对大豆抗原的提取结果差异很大。高温使发酵后的臭柏表面蛋白变性，产生美拉德反应。Tris-HCl提取物不能提取变性蛋白包裹的抗原蛋白。碱性溶液提取率较好，其中氢氧化钾提取大豆蛋白的提取率约为70%，尿素提取率最好(80~90%)。

样品蛋白浓度:发酵豆粕产品的加工工艺差异较大，即即使采用提取率最高的试剂进行提取，提取率也有较大差异。因此，在用SDS电泳确定每种产品的抗原之前，需要确定样品的蛋白质含量是否一致，以校正提取率的差异，否则会出现许多提取率高的产品条带。希捷速溶肽分解度高，低温干燥，热损伤低，提取率高；但部分高温处理产品提取率低，导致误判(见下图，某国际知名农牧企业提供)。

CJ推荐的蛋白质浓度测定方法如下:将离心后的样品稀释20X，将50μL与950μL BCA反应液混合均匀(20X倍数关系)，置于37℃恒温箱中30分钟。反应后测量562纳米处的吸光度。用牛血清白蛋白(牛血清白蛋白0，0.25，0.5，1，1.25毫克/毫升)与BCA (20X倍数关系，同上)混合并在37℃培养箱中反应30分钟的吸光度计算校准曲线及其方程。计算样品中40微克蛋白质的含量。