细胞凋亡检测试剂盒 细胞凋亡检测技术与方法

细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡(PCD)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自己的程序，结束自己生命的过程。这是一个活跃的、高度有序的、基因控制的过程，涉及一系列酶。细胞凋亡的概念提出至今还不到30年。但由于其在保证多细胞生物健康生存中起着关键作用，在病理学研究中对个体的正常发育和细胞凋亡的紊乱起着重要作用，人们对其机制和成分进行了广泛深入的研究，成为目前生命科学界最热门的话题之一，也是生命科学界乃至各行各业争相投资的研究领域。从近年来的SCI排名可以看出，关于信号转导的文章远远超过了关于人类第二基因组的文章，信号转导的一个重要前沿领域是细胞凋亡的研究。随着该领域研究的不断升温，出现了大量检测细胞凋亡的新技术和新方法，其中许多已经商业化，大大加快了研究进程。具体而言，对于凋亡的不同阶段，有以下方法:

1.早期检测:

1)细胞外膜上PS(磷脂酰丝氨酸)的检测:

PS从细胞膜内部向外部的转移发生在凋亡诱导后不久，

它可以用作免疫系统的识别标记。AnnexinV是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，可以特异性结合暴露在膜外的PS，然后通过简单的显色或发光系统进行检测。因为这是凋亡早期的活细胞检测(悬浮细胞和贴壁细胞都适用)，所以可以结合DNA染色或其他晚期检测方法来标记凋亡的发展阶段。

位于美国加州的BioVision是世界领先的细胞凋亡和细胞信号研究公司。其产品质优价廉，包装使用方便。生物视觉为膜联蛋白提供多种标签

v产品，并有完整的早期凋亡检测试剂盒，配有核染料PI。

本德医疗系统公司拥有安纳西

V专利，可提供各种规格的Annexin V凋亡检测试剂盒。Annexin V FITC试剂盒含有Annexin

v和核染料PI，小包装，适合检测小样品的客户。

此外，Biovision公司和德国美天尼公司提供磁珠来包被Annexin

v、凋亡细胞可以通过磁分选进行筛选。

2)细胞内氧化还原状态变化的检测:

在正常情况下，谷胱甘肽是细胞的重要氧化还原缓冲剂。细胞内的有毒氧化物通过GSH还原作用周期性去除，氧化的GSH可以被GSH还原酶快速还原。这种反应在线粒体中尤为重要，呼吸作用中许多副产物的氧化损伤将被清除。在Jurcat和一些其他类型的细胞中，细胞膜上存在ATP依赖的谷胱甘肽转移系统，该系统可由凋亡信号启动。当细胞内GSH清除非常活跃时，细胞液由还原环境变为氧化环境，可能导致细胞凋亡早期线粒体膜电位下降，从而将细胞色素C(三羧酸循环的重要成分)从线粒体转移到细胞液中，启动凋亡效应子caspase的级联反应。

因为

谷胱甘肽与氧化还原和线粒体功能密切相关。这种检测不仅对研究细胞凋亡的起始非常有用，而且对心脏病、中风和其他疾病的治疗也非常有用。但是有些细胞，比如HeLa

3T3细胞在凋亡过程中谷胱甘肽水平无明显变化，不能用该方法检测。

3)细胞色素C的定位和检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中起着重要作用。在正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的空腔中，凋亡信号刺激其从线粒体释放到细胞液中并与Apaf-1结合

(凋亡蛋白酶激活

因子-1):细胞色素C/Apaf-1复合物激活半胱天冬酶-9，半胱天冬酶-9又激活半胱天冬酶-3和其他下游半胱天冬酶。

细胞色素c氧化酶亚单位ⅳ(细胞色素c氧化酶

亚单位ⅳ:COX 4)是一种位于线粒体内膜的膜蛋白。当凋亡发生时，它保留在线粒体中，因此它是线粒体富集的一个非常有用的标记。细胞色素C

凋亡检测试剂盒能有效检测细胞凋亡过程中细胞色素c的释放。

4)线粒体膜电位变化的检测:

在细胞凋亡研究的早期，从形态学观察线粒体没有明显变化。随着对凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是凋亡的重要组成部分，并发生了许多生理生化变化。如凋亡诱导后线粒体跨膜电位发生变化，导致膜通透性改变。一种阳离子染色剂，对这种变化非常敏感，并显示不同的荧光染色。在正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，并发出强烈的红色荧光。在凋亡细胞中，由于线粒体跨膜电位的改变，以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。这两种不同的荧光信号可以通过荧光显微镜或流式细胞术清晰区分。来自Biovision的有丝分裂原

线粒体凋亡检测

试剂盒(线粒体凋亡检测试剂盒)可以简单、灵敏地分析和检测体外凋亡过程中线粒体的变化。

2.

延迟检测:

在细胞凋亡的后期，核酸内切酶(某些胱天蛋白酶的底物)切割核小体之间的细胞核DNA，产生大量长度为180-200的DNA

bp的一个DNA片段。

1)凋亡DNA阶梯检测试剂盒

细胞处理后，用常规方法分离纯化DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色。在凋亡细胞群中可以观察到典型的DNA阶梯。快速凋亡基因

梯形检测试剂盒可以快速(约1-2小时)灵敏地检测凋亡细胞中的DNA片段。

2)基于TUNEL的DNA片段分析试剂盒

在细胞凋亡中，

染色体DNA的双链断裂或单链断裂产生大量粘性3’-羟基末端。在脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，脱氧核苷酸与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物可以被标记到DNA的3’端，从而可以检测到凋亡细胞。Apo-BrdUTM分析采用两种颜色的TUNEL法通过流式细胞术检测凋亡细胞中的DNA条带。所采用的BrdU比生物素标记或地高辛酰化的方法更敏感。新添加的ApoBrdU-IHCTM是一个完整的双色免疫组织化学(IHC)检测DNA片段的试剂盒。Apo-DIRECTTM是一种非常简单的用于流式细胞分析的凋亡细胞一步标记法。

3)胱天蛋白酶分析试剂和试剂盒

Caspase在细胞凋亡中起重要作用，属于天冬氨酸蛋白酶。Caspase-3是关键的执行分子，在许多凋亡信号通路中起作用。在正常条件下，半胱天冬酶家族以无活性酶原(30 ~ 50 kD)的形式表达，由原始结构域、大亚基(~20kD)组成

)和小亚基(~ ~10kD

).当凋亡发生时，半胱天冬酶可被蛋白酶裂解，大小亚单位形成活化的半胱天冬酶。经过一些半胱天冬酶的激活，可以激活其他半胱天冬酶，形成半胱天冬酶级联反应，促进细胞凋亡。