孢子序列号 保健食品用菌种致病性评价程序（2019版）

保健食品菌种致病性评价程序

1范围

本程序规定了保健食品生产中使用的菌株(包括细菌、丝状真菌和酵母)的致病性评价程序。

本规程规定了两种微生物的致病性评价，即保健食品的活性成分(活菌)和保健食品生产发酵用菌株。

本程序适用于申请保健食品审批时对生产用菌株的致病性评价。待评价菌株生产的产品中其他成分的评价应参照国家相关规定进行。

本程序不适用于评估转基因微生物的致病性。

2术语和定义

2.1致病性，致病性

微生物感染宿主并导致健康损害和疾病的能力。

2.2产毒性，产毒性

微生物产生对人类和动物有毒的活性代谢物的能力。

2.3毒性，毒性

微生物有毒代谢物对宿主健康的损害。

3.待评价微生物菌株的基本要求

3.1基本信息

名称(包括学名、俗名、拉丁名等。)，菌株的来源和用途。

3.2菌株的分类数据

提供具有菌株鉴定资质的检验机构出具的待评价菌株的标准化、科学化的分类数据(属、种、菌株名称或菌株编号)。细菌的分类和命名应遵循国际原核生物系统学委员会的规定，并符合国际原核生物命名规范的要求。真菌的分类和命名应遵循藻类、真菌和植物的国际命名规范。

3.3菌株的鉴定数据

根据目前现有的知识，我们可以基于表型或最新的基因测序技术提供物种水平的准确鉴定数据。

3.4菌株生长的环境条件数据

提供最佳培养基和培养条件(培养时间、培养温度和湿度、光照等)。)进行菌种的生长，以及菌种的保存和复壮方法等。

3.5突变株

详细的诱变方法(包括所用诱变剂、诱变条件和诱变实验程序等。)应为诱变菌株提供。

3.6生产相关信息

包括但不限于记录、工艺流程、企业标准等。安全地用于保健食品工业的生产。

3.7其他国家的审批数据

提供生产和使用被评估为健康食品或其他国家批准的普通食品的菌株的信息；

3.8其他需要说明的信息。

4评估方法

4.1国内外安全评价数据汇总

根据国内外文献资料，提供国内外待评价菌株的使用历史和安全性评价数据，包括其致病性和产毒能力的报告、科技文献或综述等。；如果没有上述待评价菌株的数据，应提供同一物种或其相似物种内其他菌株的安全性评价数据。

4.2全基因组测序，WGS)

4.2.1基因测序

对待评估菌株的全基因组进行测序，并提供包括但不限于以下内容的信息:

-DNA提取法

-排序方案和设备

-顺序组装方法

-序列质量评估

-FASTA文件

-与预期基因组大小相关的重叠群总长度

-基因注释过程

-对于真菌，有必要提供从相关数据库获得的注释质量信息。

4.2.2基因序列分析

将待评估菌株的基因组序列与现有数据库最新版本(包括但不限于VFDB、PAI DB、MvirDB、CGE等)中存储的序列进行比较。)，并分析待评价菌株的遗传物质中是否存在与致病性相关的已知毒力因子和毒素代谢基因。至少提供一份包括以下信息的分析报告:

-毒力(或产毒性)基因名称、位置、与最新数据库中的毒力基因的匹配程度等。

-编码的蛋白质和序列号

-毒力因子(毒素产生、入侵和粘附因子等。)

-同源百分比和e值

-已在数据库中完整描述的菌株名称

-基因组图

-待评估的真菌菌株也应根据文献报道的毒素类型，有针对性地搜索是否存在合成毒素的关键基因。

4.3动物致病性试验

按照附录A、B、C中的实验方案，由具有检测评估细菌、真菌、酵母菌对动物的致病性的资质的机构对保健食品进行实验、评估并出具报告。

4.4中毒生产实验

对于一些能产生真菌毒素的真菌，毒性试验应在各种底物(单一品种固体、多品种固体化合物、不同成分的液体组合等)中进行。)，有毒活性代谢物的含量应按国家标准检测方法或国际组织/相关国家规定的标准检测方法进行检测。

根据我国批准的可用于保健食品的真菌名录，用于保健食品生产的红曲菌应进行桔霉素生产的检测。

5结果判断

5.1如有下列结果之一以上，则认为该菌株致病风险低，可作为保健食品生产用菌株

5.1.1三个以上的国家已批准将其作为食品或保健食品的菌种，并有长期(超过30年)使用历史。

5.1.2全基因序列分析结果表明，不存在已知的毒力相关基因或毒素合成的关键基因；

5.1.3动物实验显示无致病性。

5.1.4毒性试验结果表明，试验基质中未产生毒性活性代谢物。

5.2如果出现下列结果之一，则认为有患病风险，不能作为保健食品生产的菌种。

5.2.1根据现有知识，全基因序列分析发现存在已知的毒力基因(或毒素合成的关键基因)；

5.2.2动物试验结果显示致病性；

5.2.3毒理学实验表明，毒性活性代谢物可在任何受试基质中产生。

5.3其他需要综合判断的情况

5.3.1全基因序列中存在已知的毒力基因(或毒素合成的关键基因)，但动物实验表明其不致病，或在毒素产生实验中未检测到已知的毒性活性代谢物；

5.3.2全基因测序未发现已知毒力基因(或毒素合成的关键基因)，但动物实验表明其具有致病性，在毒素产生实验中未检测到已知的毒性活性代谢物；

出现上述情况时，应结合国内外使用历史和安全性评价资料、国内外文献综述、生产工艺、生产条件以及最终产品中是否存在生产菌株等进行综合判断。

附录A

(规范性附录)

保健食品细菌致病性的试验方法

1范围

本方法规定了保健食品用细菌的致病性试验方法。

该方法适用于评价保健食品中细菌的致病性。

2设备和材料

除微生物实验室的常规灭菌和培养设备外，其他设备和材料如下:

2.1恒温培养箱:36℃±1℃。

2.2电子天平:灵敏度0.1 g..

2.3锥形瓶:容量500毫升。

2.4无菌吸管:1毫升(带0.01毫升刻度)和10毫升(带0.1毫升刻度)。

2.5无菌试管:16×160 mm。

2.6显微镜:10á~ 100á。

2.7微量吸管和枪头:1.0毫升..

2.8注射器:1.0毫升..

2.9用针灌注小鼠。

2.10厌氧培养装置:厌氧池和厌氧箱。

2.11二级生物安全柜

3培养基和试剂

3.1 0.85%无菌盐水:商业盐水，或溶于1000毫升自来水中的8.5氯化钠，121℃高压灭菌15分钟，备用。

3.2 LB肉汤培养基:商品培养基按产品规格用蒸馏水配制，充分加热溶解后包装，121℃高压灭菌15 min，制成LB肉汤培养基备用。

3.3 LB琼脂平板:商品培养基按产品规格用蒸馏水配制，充分加热溶解后包装，121℃高压灭菌15 min，制成LB琼脂平板备用。

3.4 MRS肉汤培养基:商品培养基按产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后包装，121℃高压灭菌15 min，制成MRS肉汤培养基备用。

3.5 MRS琼脂平板:商品培养基按产品规格用蒸馏水配制，充分加热溶解后包装，121℃高压灭菌15 min，制成MRS琼脂平板备用。

3.6双歧杆菌琼脂平板:市售培养基按产品规格用蒸馏水配制，充分加热溶解后包装，121℃高压灭菌15 min，制成双歧杆菌琼脂平板备用。

4只实验动物

选用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，体重18.0 ~ 22.0克。

5个操作步骤

所有待评估的菌株必须通过腹腔注射和口服管饲法感染，以评估菌株对动物的致病性。

5.1腹膜内注射

5.1.1细菌的活化和细菌悬浮液的制备

到目前为止，我国批准的保健食品用菌株主要是双歧杆菌和乳酸杆菌，新申报的菌株在以下描述中被归类为其他细菌。

根据菌株的培养特点，双歧杆菌和乳酸杆菌接种MRS肉汤，其他细菌接种LB肉汤，在合适的培养条件(包括培养温度、湿度、厌氧、好氧、微好氧等)下培养。)培养一定时间后，双歧杆菌接种MRS琼脂平板或双歧杆菌琼脂平板，乳酸菌接种MRS琼脂平板，其他细菌接种LB琼脂平板，培养一定时间后，刮去平板上的菌落。悬浮在无菌生理盐水中，混匀，用适当的无菌生理盐水调节菌悬液的浓度，比浊法测菌悬液中细菌细胞的最终浓度不低于5.0×107 CFU/毫升。

5.1.2腹腔注射

40只小鼠，雌雄各半，随机分为4组(每组10只)，包括雄性小鼠悬液灭活对照组、雄性小鼠悬液灭活对照组、雌性小鼠悬液灭活对照组和雌性小鼠悬液组。将0.2毫升注射到每只小鼠中，使得注射到每只小鼠中的细菌量至少为107 CFU/小鼠。

5.1.3动物观察

腹腔注射后，每天观察动物一次，持续至少21天。

观察动物的以下(但不限于)异常情况:(1)皮肤和毛发；(2)眼睛和粘膜；(3)呼吸系统；(4)体力活动；(5)行为模式；(6)特别注意振动、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎、昏迷等现象；(7)体重:注射前和注射后每周称一次所有小鼠的体重，测量实验过程中死亡和最终处死的小鼠的体重。如果小鼠存活时间超过1d，记录体重变化；(8)尽可能准确地记录小鼠的死亡时间。

5.2口服管饲

5.2.1细菌的活化和细菌悬浮液的制备

除菌悬液浓度不低于2.5×108 CFU/毫升外，其他操作步骤同5.1.1。

5.2.2灌胃

40只小鼠，雌雄各半，随机分为4组(每组10只)，包括雄性小鼠悬液灭活对照组、雄性小鼠悬液灭活对照组、雌性小鼠悬液灭活组、雌性小鼠悬液灭活组。分别给予小鼠2.0毫升/100克体重的剂量。他们应该在胃灌注前禁食一夜，并在胃灌注后3-4小时进食。

5.2.3观察

与5.1.3相同。

6结果和报告

对5.1和5.2的实验结果进行统计分析和评价，包括:

(1)评价菌株对动物体重的影响是否具有统计学意义；

(2)动物异常特征的时间和症状描述，异常动物的数量等。，包括每只动物的死亡时间；

(3)试验组动物在试验过程中未出现中毒症状或死亡，对其生长发育无统计学意义，可判断该菌株无致病性；当试验组动物在试验过程中出现中毒症状或死亡，或在试验过程中影响其生长发育时，即可判断该菌株具有致病性。

附录B

(规范性附录)

保健食品用丝状真菌致病性的试验方法

1范围

本方法规定了保健食品用丝状真菌的致病性试验方法。

该方法适用于评价保健食品中丝状真菌的致病性。

2设备和材料

除微生物实验室的常规灭菌和培养设备外，其他设备和材料如下:

2.1培养箱:28℃±1℃。

2.2电子天平:灵敏度0.1 g..

2.3锥形瓶:容量500毫升。

2.4无菌吸管:1毫升(带0.01毫升刻度)和10毫升(带0.1毫升刻度)。

2.5显微镜:10á~ 100á。

2.6微量吸管和枪头:1.0毫升..

2.8浊度计。

2.9注射器:1.0毫升..

2.10用针灌注小鼠。

2.11接种针。

2.11二级生物安全柜

3培养基和试剂

3.1麦汁琼脂平板:商品培养基按产品规格用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121℃高压灭菌15 min，制成麦汁琼脂平板备用。

3.2马铃薯葡萄糖琼脂平板:商品培养基按产品规格用蒸馏水配制，充分加热溶解后包装，121℃高压灭菌15 min，制成马铃薯葡萄糖琼脂平板备用。

3.3 0.85%无菌盐水:商业盐水，或溶于1000毫升蒸馏水中的8.5克氯化钠，121℃高压灭菌15分钟，备用。

4只实验动物

选用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，体重18.0 ~ 22.0克。

5个操作步骤

所有待评估的菌株必须通过腹腔注射和口服管饲法感染，以评估菌株对动物的致病性。

5.1腹膜内注射

5.1.1细菌的活化和细菌悬浮液的制备

将待接种的菌株接种到合适的培养基中。到目前为止，除了可用于保健食品的红曲霉菌株外，国内认可的菌株都接种在马铃薯葡萄糖琼脂平板上。在28℃±1℃培养7天至14天后，将平板上的菌落刮去并悬浮在无菌生理盐水中。充分混合后，用适量无菌生理盐水调节菌悬液的浓度，用比浊法测定菌悬液中的最终孢子

5.1.2注射

40只小鼠，雌雄各半，随机分为4组(每组10只)，包括雄性小鼠悬液灭活对照组、雄性小鼠悬液灭活对照组、雌性小鼠悬液灭活对照组、雌性小鼠悬液灭活组。每只小鼠注射0.2毫升，使注射入每只小鼠的孢子量不低于107 CFU/小鼠。

5.1.3观察

腹腔注射后，每天观察动物一次，持续至少21天。

观察以下(但不限于)动物的异常情况:(1)皮肤、毛发；(2)眼睛和粘膜；(3)呼吸系统；(4)体力活动；(5)行为模式；(6)特别注意振动、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎、昏迷等现象；(7)体重:每周称量注射前后所有小鼠的体重，测量实验期间死亡、观察期内存活、最后死亡的小鼠的体重。如果小鼠存活时间超过1d，记录体重变化；(8)尽可能准确地记录小鼠的死亡时间。

5.2口服管饲

5.2.1细菌的活化和细菌悬浮液的制备

除制备浓度不低于2.5×108 CFU/毫升的菌悬液外，其他操作步骤同5.1.1。

5.2.1灌胃

40只小鼠，雌雄各半，随机分为4组(每组10只)，包括雄性小鼠悬液灭活对照组、雄性小鼠悬液灭活对照组和雌性小鼠悬液组。小鼠灌胃给药剂量为2.0毫升/100克体重，灌胃前禁食过夜，灌胃后3 ~ 4小时喂养。

5.2.2观察

与5.1.3相同。

6结果和报告

对5.1和5.2的实验结果进行了统计分析和评价，包括以下内容:

(4)菌株对动物体重的影响是否有统计学意义；

(5)动物异常特征的时间和症状描述，异常动物的数量等。，包括每只动物的死亡时间；

(6)试验组动物在试验过程中未出现中毒症状或死亡，对其生长发育无统计学意义，可判断该菌株无致病性；当试验组动物在试验过程中出现中毒症状或死亡，或在试验过程中其生长发育受到影响时，即可判断该菌株具有致病性。

附录三

(规范性附录)

保健食品酵母致病性的试验方法

1范围

本方法规定了保健食品酵母的致病性试验方法。

该方法适用于评价酵母对保健食品的致病性。

2设备和材料

除微生物实验室的常规灭菌和培养设备外，其他设备和材料如下:

2.1培养箱:28℃±1℃。

2.2电子天平:灵敏度0.1 g..

2.3锥形瓶:容量500毫升。

2.4无菌吸管:1毫升(带0.01毫升刻度)和10毫升(带0.1毫升刻度)。

2.5显微镜:10á~ 100á。

2.6微量吸管和枪头:1.0毫升..

2.8浊度计。

2.9注射器:1.0毫升..

2.10用针灌注小鼠。

2.11温湿度计。

2.12接种针。

2.13二级生物安全柜

3培养基和试剂

3.1麦汁琼脂平板:商品培养基按产品规格用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121℃高压灭菌15 min，制成麦汁琼脂平板备用。

3.2 0.85%无菌生理盐水:市售生理盐水，或溶于1000mL蒸馏水中的8.5g氯化钠，121℃高压灭菌15 min，备用。

4只实验动物

选用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，体重18.0 ~ 22.0克。

5个操作步骤

所有待评估的菌株必须通过腹腔注射和口服管饲法感染，以评估菌株对动物的致病性。

5.1腹膜内注射

5.1.1细菌的活化和细菌悬浮液的制备

将待送的菌株接种到麦汁琼脂平板上，在28℃±1℃培养2 d ~ 7 d，刮去平板上的菌落，悬浮于无菌生理盐水中，混匀，用适量无菌生理盐水调节菌悬液浓度，用浊度调节菌悬液中细菌最终浓度不低于5.0×107 CFU/毫升。

5.1.2注射

40只小鼠，雌雄各半，随机分为4组(每组10只)，包括雄性小鼠悬液灭活对照组、雄性小鼠悬液灭活对照组、雌性小鼠悬液灭活对照组和雌性小鼠悬液组。每只小鼠注射0.2毫升，使每只小鼠注射的细菌量不低于107 CFU/小鼠。

5.1.3观察

腹腔注射后，每天观察动物一次，持续至少21天。

在动物中观察到以下(但不限于)异常:(1)皮肤和毛发；(2)眼睛和粘膜；(3)呼吸系统；(4)体力活动；(5)行为模式；(6)特别注意振动、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎、昏迷等现象；(7)体重:每周称量注射前后所有小鼠的体重，测量实验期间死亡、观察期内存活、最后死亡的小鼠的体重。如果小鼠存活时间超过1d，记录体重变化；(8)尽可能准确地记录小鼠的死亡时间。

5.3口服管饲

5.3.1细菌的活化和细菌悬浮液的制备

除菌悬液浓度不低于2.5×108 CFU/毫升外，其他操作步骤同5.1.1。

5.3.1灌胃

40只小鼠，雌雄各半，随机分为4组(每组10只)，包括雄性小鼠悬液灭活对照组、雄性小鼠悬液灭活对照组、雌性小鼠悬液灭活对照组和雌性小鼠悬液组。小鼠通过灌胃给予2.0毫升/100克体重的剂量。他们应在灌胃前禁食一夜，并在灌胃后3-4小时进食。

5.3.2观察

与5.1.3相同。

6结果和报告

对5.1和5.2的实验结果进行了统计分析和评价，包括以下内容:

(7)评价菌株对动物体重的影响是否具有统计学意义；

(8)动物异常特征的时间和症状描述，异常动物的数量等。，包括每只动物的死亡时间；

(9)试验组动物在试验过程中未出现中毒症状或死亡，对其生长发育的影响无统计学意义，可判断该菌株无致病性；当试验组动物在试验过程中出现中毒症状或死亡，或在试验过程中其生长发育受到影响时，即可判断该菌株具有致病性。(来源:国家市政监督局转发:北京田健华成国际投资咨询有限公司www.zhuceabc.cn)