elisa ELISA常用方法+操作视频+常见问题问答

酶联免疫吸附试验的原理和类型

酶联免疫吸附试验是一种免疫分析技术，广泛用于测定液体样品中的蛋白质、抗体或激素。酶联免疫吸附试验(ELISA)的标准程序是将蛋白质、抗体或激素(即抗原)直接或用捕获抗体(捕获Ab)固定在固体载体上，然后加入初级检测抗体(初级检测Ab)形成抗原-抗体复合物。如果抗体已经被酶标记，可以直接用于确定抗原的量，否则，可以使用另一种酶标记的二级抗体来确定抗原的量。测定抗原量的方法是加入酶的底物，作用后产生的颜色与样品中抗原的量成正比。根据这一原理，可以计算出样品中抗原的总量或浓度。

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1.直接酶联免疫吸附试验

抗原的总量可以通过直接将抗原固定在固体载体上，加入酶标记的一级抗体来确定。这种一级抗体的特异性非常重要。

优点:操作程序短，无需使用二抗即可避免相互作用。

缺点:实验中所有一级抗体都要用酶标记，但不是每种抗体都适合标记，成本相对增加。

2.间接酶联免疫吸附试验

这种测定方法和直接法类似，不同的是一级抗体没有酶标记，用酶标记的二级抗体鉴定一级抗体来确定抗原的量。

优点:二抗可以增强信号，有多种选择可以做不同的测定和分析。没有酶标记的一级抗体能保持最大的免疫反应性。

缺点:互动概率高。

3.夹心酶联免疫吸附试验

被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定在固体载体上，即捕获抗体。另一种是检测抗体，可以用酶标记，直接测抗原量；或者未标记，然后通过酶标记的二级抗体确定抗原的量。必须仔细选择这两种抗体，以避免对同一抗原结合位点的相互作用或竞争。

优点:灵敏度高，特异性高，抗原无需预先纯化。

缺点:一个抗原必须有两个以上的抗体结合位点。

4.竞争法(竞争性酶联免疫吸附试验)

样品中的抗原(游离抗原)与纯化并固定在固体载体上的抗原(固定抗原)竞争相同的抗体。当样品中游离抗原较多时，能结合的抗体较多，而固定抗原只能结合较少的抗体，反之亦然。洗涤步骤后，将游离抗原和抗体的复合物洗去，只留下固定抗原和抗体的复合物，与仅固定抗原的对照组的结果进行比较，根据色差可以计算出样品中的抗原含量。

优点:适用于不纯样品，数据重现性高。

缺点:整体灵敏度和特异性差。

5.最新的酶联免疫吸附技术

基于细胞的ELISA:是一种新的蛋白质定性检测技术，直接在微孔板中培养细胞，不需要提取蛋白质和裂解细胞，直接测定刺激或抑制后微孔板中蛋白质的变化。

优点:不需要裂解细胞，所以靶蛋白损失最小，可以确定全细胞、贴壁细胞和非贴壁细胞。

缺点:抗原量无法确定。

影响酶联免疫吸附试验结果的原因及解决方法

样本收集和保存

酶联免疫吸附测定最常用的临床标本是血清(血浆)。应注意避免严重溶血，因为血红蛋白含有具有过氧化物样活性的血红素基团，在孵育过程中容易吸附在固相上，与HRP底物反应产生假阳性。

在样品采集和血清分离中，应注意避免细菌污染。一方面，细菌分泌的酶可能分解抗原、抗体等蛋白质；另一方面，细菌的内源酶，如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶，可能对相应酶标记的测定方法造成非特异性干扰。

样品应避免反复冷冻和解冻。反复冻融产生的机械剪切力会破坏标本中的蛋白质等分子，导致假阴性结果。另外，样品混合均匀时，不要剧烈摇晃，反复上下颠倒混合。

一般来说，如果在采集样品的当天进行测试，样品可以及时保存在4℃下备用；但第二天要检测的样品要及时包装，在-20℃冷冻备用。如果样品要长期保存，最好在-70℃冷冻。

3)在表格菜单栏的插入散点图中选择第一种类型

4)在图表工具的快速布局中选择fx图标，得到下图。如果Excel版本更低，可以直接跳到步骤6)。

5)点坐标轴标题，可以修改。修改后可得到以下标准曲线。

6)或者在较低版本的excel中，选择图表工具选项中的趋势线|线性趋势线。

7)在图表中选择趋势线，右键选择“设置趋势线格式”。在弹出的对话框中，勾选“显示公式”，点击“关闭”，得到标准曲线。

8)可以将试管中测得的吸光度值代入图表中的公式Y=1.001x+0.0171，得到所需成分的含量，即x值。

酶联免疫吸附试验的疑难疾病

1)浅色渲染和低灵敏度

2)误报多，背景高，甚至花板

3)重复性差

4)白板

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声音

明亮的

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