茉莉酮酸 项目文章 | SCIENCE子刊：茉莉酮酸调控青蒿素合成机制

基本信息

论文题目:茉莉通过激活青蒿中的磷酸三钙-14-ora复合物来促进青蒿素的生物合成

出版期刊:科学进步

发布日期:2018年11月

影响因素:11.511

作者:上海交通大学唐克轩教授课题组

本文涉及的高通量技术:酵母双杂交文库(由欧亿生物提供)

研究背景

青蒿素及其衍生物(蒿甲醚和青蒿琥酯)是最好最快的抗疟药。青蒿是青蒿素的唯一天然原料。而青蒿素主要合成积累在叶表面的分泌腺毛中，但其干重仅占青蒿干重的0.01%-1%。目前，利用工程酵母半合成生产青蒿素的方法非常有限，青蒿仍然是青蒿素的主要来源。因此，通过代谢工程研究青蒿素合成途径的转录调控网络，提高青蒿素的含量已成为全球研究热点。

研究内容

通过酵母双杂交筛选文库，研究人员发现青蒿腺毛特异性表达的AaORA可以与AaTCP14相互作用，结合并激活青蒿素合成途径的两个关键基因即双键还原酶2(DBR2)和醛脱氢酶1(ALDH1)的启动子。此外，通过酵母三杂交和荧光素酶互补实验，研究人员发现茉莉酸信号抑制剂AaJAZ8通过与AaTCP14和AaORA相互作用，可以抑制AaTCP14-AaORA复合物对DBR2启动子的激活。相反，茉莉酸处理诱导的AaJAZ8降解可以释放AaTCP14-AaORA复合物的抑制作用，促进青蒿素的合成。

本文阐明了茉莉酸激活AaTCP14-AaORA复合物和调节青蒿素合成的新机制。

研究思路

研究结果

1.AaORA可以在体内激活青蒿素合成途径的4个关键基因ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1，但AaORA与这4个启动子的相互作用无法通过酵母单杂交实验来验证。这一结果表明AaORA可能与其他转录因子相互作用并发挥其转录激活功能。

利用无自激活功能的AaORA蛋白c端作为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛选，获得了潜在的相互作用蛋白AaTCP14。并通过酵母双杂交一对一实验、谷胱甘肽硫转移酶下拉、BiFC和Co-IP验证。

2.用qRT-PCR方法研究AaTCP14的时间空表达，发现AaTCP14在幼叶中大量表达，并随着叶片的发育而逐渐减少。表达模式类似于AaORA和其他青蒿素合成基因。此外，AaTCP14在腺毛、幼苗、花和苞片中高度表达，而在根中表达水平较低。此外，检测到AaTCP14启动子的组织特异性表达，表明其位于非分泌型(TST)和分泌型(谷胱甘肽转移酶)腺毛中。

AaORA由茉莉酸甲酯诱导，处理9小时后达到高峰。QRT聚合酶链反应结果表明，茉莉酸甲酯处理9小时后，AaTCP14的表达水平达到峰值。因此，AaORA和AaTCP14在响应茉莉酸甲酯处理时具有相似的表达模式，并且可以诱导青蒿素的合成。此外，作为转录因子，亚细胞定位实验表明，TCP14位于细胞核内。

青蒿中AaTCP14的过表达揭示了青蒿素相关基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)和茉莉酮酸途径相关基因(AaAOC和AaOPR3)的表达也显著增加，这表明AATCP 14可能激活青蒿素相关基因的表达并增加青蒿素的产量。研究人员通过高效液相色谱法证实，与野生型植物相比，AaTCP14过表达植物中青蒿素和二氢青蒿素的含量分别增加了80-120%和10-120%，而青蒿素的含量减少了45-69%。此外，构建了反义表达AaTCP14的转基因植物，显著降低了青蒿素和茉莉酸相关基因的表达。同时，青蒿素、二氢青蒿素酸和青蒿素酸的含量分别下降了19-25%、20-72%和11-37%。以上结果表明，AaTCP14是青蒿素合成途径的激活剂，可作为基因工程提高青蒿青蒿素产量的目标。

4.双荧光素酶报告实验证明AaTCP14能激活DBR2和ALDH1的表达。此外，酵母单杂交证明AaTCP14可以与DBR2和ALDH1启动子上的TCP结合位点结合。此外，研究人员通过EMSA在体外验证了AaTCP14和AATCP 14的组合。

5.双荧光素酶报告实验表明，AaTCP14和AaORA均可激活DBR2和ALDH1的启动子，二者之间的协同作用可显著提高靶基因的激活能力。值得注意的是，茉莉酸甲酯处理可以提高AaTCP14和AaORA的转录激活能力。以上结果表明，AaORA可以通过与AaTCP14相互作用来提高其转录激活能力，这种协同作用是由茉莉酸甲酯诱导的。

为了阐明AaTCP14-AaORA复合物对青蒿素合成的影响，研究人员构建了过量表达AaTCP14和AaORA的青蒿转基因植物。DBR2和ALDH1的表达水平显著增加，证明了AaTCP14-AaORA在体内的调节作用。高效液相色谱分析表明，青蒿素、双氢青蒿素和青蒿素的含量明显高于野生型植物，而转基因植物没有其他明显的表型。

研究人员进一步构建了AaORA过表达和沉默的转基因植物，表明AaTCP14和AaORA在转录水平上的表达是相互独立的。

6.茉莉酸信号通路的负调节因子。AaJAZ8能抑制青蒿素的合成。酵母双杂交、BiFC、荧光素酶互补实验和Co-IP证实AaJAZ8能分别与AaTCP14和AaORA相互作用。此外，共定位实验证实AaJAZ8、AaTCP14和AaORA位于同一核内。此外，AaMYC2还可以与其他AaJAZ蛋白(AaJAZ5、AaJAZ6、AaJAZ8和AaJAZ9)相互作用。

7.为了阐明AaJAZ8是否可以调控AaTCP14和AaORA的相互作用，研究人员采用酵母三杂交和荧光素酶互补实验。结果表明，AaJAZ8抑制了AaTCP14与AaORA的相互作用。进一步通过分段克隆进行酵母双杂交，证实AaJAZ8可以与AaORA竞争结合AaTCP14的c端，阻止AaTCP14与AaORA的相互作用。

另外，通过双荧光素酶报告实验，研究人员发现AaJAZ8可以显著降低AaTCP14-AaORA复合物对靶基因DBR2的转录激活能力，这种抑制作用可以通过茉莉酸甲酯来弥补。

总结

酵母单、双、三杂交的完美结合，揭示了AaTCP14-AaORA复合体与青蒿素合成调控因子MYC2、GSW1、JAZ8的关系，阐明了茉莉酸调控青蒿素生物合成的新机制。

引用

马亚楠、徐冬北等(2018)。茉莉酸通过激活黄花蒿中的TCP14-ORA复合物促进青蒿素的生物合成。https://doi.org/10.1126/sciadv.aas9357.科学进步

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