在《新药研发中的HCP(上)》中，边肖介绍了HCP ELISA的检测技术，以及美国和欧盟药典推荐的一种基于荧光标记的HCP ELISA抗体覆盖率评价新方法:差分荧光印迹电泳(DIGE/DIBE)。本文详细介绍了DIBE技术的工作原理、配胶过程以及HCP酶联免疫吸附试验覆盖率的计算方法。
如前一期所述，评估HCP酶联免疫吸附试验抗体覆盖率的最佳方案是双向电泳和蛋白质印迹相结合。但是由于传统的双向电泳，每个凝胶只能实现一个通道样品的成像，凝胶之间不可控的差异、凝胶的变形和化学发光的一次性成像会直接影响实验结果的重复性，导致凝胶点匹配困难，严重制约了HCP ELISA抗体覆盖率的评估。
差分荧光印迹电泳可以实现一个样品，只需要一个凝胶，并得到可靠的HCP酶联免疫吸附试验抗体覆盖率的评价结果。
差分荧光印迹电泳技术的工作原理是:电泳前，样品用CyDye染料Cy3标记，双向电泳分离后，直接转移膜并密封，HCP试验抗体为第一抗体，进行第一次孵育，第二抗体与CyDye染料偶联。二抗孵育后，可直接用于多通道激光扫描成像，无需使用任何发光液体。印迹膜也可以干燥避光几个月，随时取出反复观察。
上述DIBE技术的实现受益于三个方面:
首先，高感光度CyDye染料和银染料感光度对比如下图。
其次，扫描成像设备信噪比高，全自动方式抗猝灭。
全光谱双光电倍增管探测器
多荧光通道自动扫描成像
最后，HCP酶联免疫吸附覆盖专用分析软件。
自动胶点匹配，2D/3D跟踪显示。
实现了HCP酶联免疫吸附试验覆盖率的自动计算和结果评估。
那么，DIBE技术能否通过CCD摄影成像来实现呢？经过一点验证，我们会发现共焦模式的扫描成像仪的图像信噪比比高灵敏度的CCD成像强得多。
最终，CCD拍摄的图像中大约有10%的胶点“丢失”。
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