【excel怎么算rsd】演示加压毛细管电色谱在瓜菜果汁饮料有机酸研究中的应用。

摘要：制作一种加压毛细管电色谱法，可以同时测定调味品水果和蔬菜汁饮料中的草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸。样品通过提取10%乙醇并添加超声波30min检测80%乙腈-水(含0.05mol/LKH2PO4)，应用5kV电压分离，二极管阵列检测器的检测波长为210nm，按外部标准峰值面积定量。结果表明，5种目标在1.0 G/ML ~ 50.0 G/ML浓度范围内呈线性良好，检测限值为0.20毫克/千克~ 0.30毫克/千克，定量限值为0.60毫克/千克~ 1.0毫克/千克。该方法具有操作简单、特质强、灵敏度高的优点，可以满足调味水果和蔬菜汁饮料中多种有机酸的检测要求。

关键词：分析化学加压毛细管有机酸果菜汁饮料、电色苹果酸调料。

有机酸作为食品添加剂添加到食品中，具有提高酸味和调节pH值的作用，常用苹果酸、乙酸、柠檬酸等[1，2]。调味水果和蔬菜汁饮料是指水果和蔬菜汁中添加其他食品辅料，富含对人体有益的碳水化合物、维生素和矿物质的特性，深受消费者欢迎。调味水果和蔬菜汁饮料中一般添加苹果酸、柠檬酸等有机酸作为酸度调节剂，调节饮料的pH值，改善饮料的味道，延长产品保质期的作用[3，4]。调味品水果和蔬菜汁饮料中有机酸不足或过量会导致口感不协调，因此应检查和监测这种产品中有机酸的使用情况[5，6]。

调味品水果和蔬菜汁饮料研究中检测营养成分的研究较多，但与之相关的有机酸的检测研究较少。参考相关有机酸的检测方法，主要有离子色谱[7，8，9，10]、气相色谱[11，12]和高效液相色谱[13，14，15]，3种方法有优点，但分析时间长。加压毛细管电色谱技术是毛细管电泳和高效液相色谱相结合、选择性电微分离技术，具有双重分离机制[14，15，16]。与传统的高效液相色谱相比，除了压力毛细管电色谱、压力流量驱动外，更适合于电渗流驱动、提高柱效率、提高分离速度、检测复杂样品的多成分。本研究结合加压毛细管电色谱的双分离机制和二极管阵列检测器的优点，开发了一种分析和检测调味品果汁饮料中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乙酸共5种有机酸的新方法，优化了预处理方法，开发的pCEC-PDA检测方法操作简单，分析速度快，具有实用价值。

1、材料和方法

1.1仪器和试剂

2100型加压毛细管电色谱系统、U3000型二极管阵列探测器：美国塞默比。

草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乙酸标准品：国家标准物质中心。

1.2色谱条件

色谱仪柱：WaterssunfireC18250mm，5 m)；5 m)；流量：0.8ml/分钟；注入量：20 L。

柱温度：30；流动相为乙腈：水=80: 20(体积比)。

1.3试验方法

参考相关文献[17，18，19]中有机酸的分离条件，利用亲水作用毛细管谱柱分离5种有机酸。另外，通过流动相添加剂体系、电压强度分离条件优化、波长选择检测、预处理条件优化，最终确定了分析调味品水果蔬菜汁饮料中5种有机酸的总体方法。

1.3.1流动相添加剂对有机酸色谱行为的影响

本实验以流动相(乙腈：水=80: 20，体积比)为基准，在流动相上分别添加磷酸二氢钾(0.05mol/L，)、偏磷酸(0.01mol/L，)和磷酸二氢()

1.3.2电压强度对有机酸色谱行为的影响

电压是加压毛细管电色谱实验条件中重要的实验参数，施加不同的电压强度会对样品的分离能力和分离速度产生不同的影响，分别应用0、2、4、5、8kV正向电压，考察5种有机酸从不同电压强度分离的情况。

1.3.3检测波长选择

影响二极管阵列探测器灵敏度的关键参数通常是特征波长选择。较好的特征波长选择应减少杂质峰对目标的影响，减少干扰，通常在设置适当的二极管阵列检测方法时对该参数进行优化。

1.3.4制作标准曲线

分别吸收一定质量的5种有机酸标准品，用浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、50.0g/mL的混合液配制，绘制仪器分析和标准曲线。

1.3.5样品预处理方法的优化

液体样品提取溶剂常用的有甲醇、醚、磷酸、偏磷酸、乙醇等。由于甲醇、尿素具有一定毒性，在用磷酸、偏磷酸提取调味品水果蔬菜汁时，由于提取液中酸根阴离子的存在，影响有机酸的分离测定，因此综合考虑选择乙醇作为萃取剂，优化萃取剂的浓度。

不同提取方式对目标物提取有较大影响，以乙醇为提取剂，为10%，比较了5种不同的方式。

的提取效果。方式Ⅰ：样品提取剂加入调味果蔬汁饮品后直接离心（5000r/min,10min）；方式Ⅱ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后静置30min，离心（5000r/min,10min）；方式Ⅲ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后均质，离心（5000r/min,10min）；方式Ⅳ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后振荡30min，离心（5000r/min,10min）；方式Ⅴ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后超声30min，离心（5000r/min,10min）。

1.3.6加标回收试验及样品的检测

以已知含量有机酸的调味果蔬汁饮品为基质，加入混合标准液，选择优化后的前处理条件操作，上机检测，计算回收率，并以上述优化后的条件检测抽取的样品。

1.4数据处理

试验所有数据以平均值表示，采用Excel2013软件进行统计分析和绘图。

2、结果与讨论

2.1色谱条件的优化

2.1.1流动相添加剂对有机酸色谱行为的影响

有机酸在色谱系统中的分离是依据在色谱柱和流动相之间的分配系数不同而进行的，由于其组分极性较大，流动相中的水比例不能太高，否则有机酸会发生解离。为了能使5种有机酸在色谱系统中以分子形式存在，一般使用酸性流动相来进行组分的分离。本试验比较流动相（乙腈︰水=80︰20，体积比）中添加磷酸二氢钾（0.05mol/L,）、偏磷酸（0.01mol/L,）和磷酸二氢铵（NH4)2HPO4(0.05mol/L,)3种添加剂[20,21]，研究对5种有机酸色谱行为的影响，结果见图1。

图1流动相组成对有机酸色谱行为的影响

a.磷酸二氢钾；b.偏磷酸；c.磷酸二氢铵；1.草酸；2.柠檬酸；3.酒石酸；4.苹果酸；5.乙酸。

由图1可知，3种添加剂体系对5种有机酸的色谱行为影响不同。随着流动相组成的不同，5种有机酸的保留时间也不相同，且峰形、分离度和响应信号均发生了较大变化。对比3个图可知，当流动相添加剂为磷酸二氢钾（0.05mol/L,）时，5种有机酸能达到很好的分离效果；而流动相添加剂为偏磷酸（0.01mol/L,）或磷酸二氢铵（0.05mol/L,）时，5种有机酸并不能达到相应的分离效果，且检测基线不稳定、噪音较大。因此，本研究选择流动相添加剂为磷酸二氢钾。

2.1.2流动相添加剂pH值对有机酸色谱行为的影响

在流动相中加入0.05mol/L磷酸二氢钾，固定流速为0.8mL/min，柱温为30℃，4kV正向电压，用100mmol/L磷酸调节流动相添加剂的pH值，比较2.1、2.3、2.5、2.7、2.9五个不同pH值的流动相添加剂对5种有机酸组分保留时间和分离度的影响，结果见图2。

由图2可知，从保留时间上看，随着流动相pH值的增大，草酸、柠檬酸、酒石酸的保留时间延长，而苹果酸、乙酸的保留时间基本不受流动相pH值的影响。从分离度上看，随着流动相pH值增加，草酸、柠檬酸和酒石酸分离度越好。综合考虑保留时间和分离度，选择的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相添加剂较佳。

图2流动相添加剂pH值对有机酸保留时间的影响

2.2电压强度的选择

在流动相中加入磷酸二氢钾溶液（0.05mol/L,），分别施加0、2、4、5、8kV正向电压，结果如图3所示。

图3电压强度对有机酸分离速度的影响

1.草酸；2.柠檬酸；3.酒石酸；4.苹果酸；5.乙酸。

由图3可知，随着电压升高，在电渗流的推动下5种有机酸的分离速度明显加快，同时色谱峰形变窄；当施加电压为+5kV时，样品分离时间加快到15min左右，苹果酸、乙酸的保留时间明显提前，并且5种有机酸样品完全分离。当施加电压达到+8kV后，分离速度无明显加快，并且仪器电流急剧增大，故本试验最终选择+5kV为施加电压。

2.3检测波长的选择

本试验采用二极管阵列检测器检测，在检测波长190nm～600nm范围内对5种有机酸的标准溶液进行全波长扫描[22,23]，根据各个组分的全波长扫描选择最大的吸收波长，结果见图4。

结果显示有4种有机酸在210nm波长附近有较大吸收，只有草酸在257nm和427nm波长处有较大吸收，综合考虑，选用210nm波长进行检测。

图45种有机酸的全波长扫描图

2.4标准曲线的制作

5种目标组分在1.0μg/mL～50.0μg/mL内均具有良好的线性关系，其中柠檬酸、酒石酸、苹果酸的检出限为0.20mg/kg，定量限为0.60mg/kg；草酸和乙酸的检出限为0.30mg/kg，定量限为1.0mg/kg，结果见表1。

表15种组分的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

2.5样品前处理方法的优化

2.5.1不同浓度乙醇溶液提取效果

图5为乙醇浓度分别为5%、10%、20%、30%、40%、50%做提取剂时各有机酸组分含量的测定结果。

图5有机酸组分含量随提取剂配比变化情况

由图5可知，以柠檬酸为例，随着乙醇浓度的增加，提取液中柠檬酸检测含量呈现先增加后下降的趋势，在以10%乙醇作为提取溶液时，柠檬酸的含量能达到5.8mg/100g，而以20%乙醇溶液和30%乙醇溶液提取时柠檬酸含量分别降低了10.3%和15.5%，以40%乙醇溶液和50%乙醇溶液提取时柠檬酸含量分别降低了34.4%和60.3%。样品中其他4种组分含量变化也类似，也表现为用10%乙醇溶液提取时含量最高，其他浓度的乙醇溶液为提取剂时，组分含量分别有不同程度的降幅。

2.5.2提取方式的选择

5种提取方式的试验结果如图6所示。

图6不同提取方式对有机酸测定结果的影响

由图6可知，以柠檬酸为例，提取方式Ⅴ显著高于其他4种提取方式；乙酸中方式Ⅴ和方式Ⅳ差异明显，但是明显高于方式Ⅲ、方式Ⅱ和方式Ⅰ；其他3种酸中也是提取方式Ⅴ的含量最高。由此可见，提取方式Ⅰ、提取方式Ⅱ和提取方式Ⅲ均有对目标物提取不完全的缺陷，而提取方式Ⅴ的效果优于提取方式Ⅳ的效果。因此，本方法选择提取方式Ⅴ即样品加入提取剂后超声30min，并离心（5000r/min,10min）的提取方式为适宜。

2.6加标回收率与精密度

以已知有机酸含量的调味果蔬汁饮品为基质，分别添加1.0、10.0、50.0mg/kg3个梯度浓度的有机酸标准混合溶液，进行加标回收试验，每个浓度重复测定5次，测定结果见表2。

表2方法的回收率及相对标准偏差(n=5)

由表2可见，5种组分3个水平的加标回收率为90.5%～95.7%，相对标准偏差（RSD）为2.3%～4.6%，表明本试验所建立的方法能够满足检测实际样品需要。

2.7实际样品测定

在市场上随机抽取5种调味果蔬汁饮品检测其中的有机酸，检测结果见表3。

表3样品中5种有机酸的测定（n=5)

由表3可以看出不同种类的调味果蔬汁饮品中含有的有机酸种类和含量差异较大，5款饮品中都含有苹果酸，而柠檬酸、酒石酸和乙酸这3种有机酸只有个别饮品中有，而草酸在这5种饮品中没有检出，整体有机酸检测到的种类与产品外包装标签中标出的一致。针对分析测定的结果，可以根据自身的需要，选用不同类型的调味果蔬汁饮品，来补充全面的或者单一的有机酸。

3、结论

本文利用加压毛细管电色谱-二极管阵列联用法，通过对流动相体系的组成、流动相添加剂的pH值、电压强度和检测波长的优化，以及样品提取液、提取方法的比较，建立了同时分离检测调味果蔬汁饮品中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸5种有机酸的亲水作用电色谱法。结果表明，采用WaterssunfireC18色谱柱，选择的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相（乙腈︰水=80︰20，体积比）的添加剂，电压强度为+5kV，流速为0.8mL/min，柱温为30℃，检测波长为210nm的条件下，5种目标组分能在1.0μg/mL～50.0μg/mL内均具有良好的线性关系，检出限范围为0.20mg/kg～0.30mg/kg，定量限范围为0.60mg/kg～1.0mg/kg。样品加入10%乙醇提取并超声30min后，加标回收率能达到90.5%～95.7%,RSD为2.3%～4.6%，所建立的方法具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测调味果蔬汁饮品中的5种有机酸的含量，可为调味果蔬汁饮品中多种有机酸的分析和监控提供技术支持。